萬英明 田 晶 齊 玲 朱辛奕

吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，吉林吉林 132021

隨著社會的發(fā)展，人們對口腔修復(fù)有了更高的要求，活動義齒、種植牙等因其穩(wěn)固、美觀舒適、咀嚼效率高等優(yōu)點越來越多的適用于臨床[1-3]。磁性附著體是被口腔醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為目前最具發(fā)展前景的新型附著體，是用于活動義齒、種植牙的一種優(yōu)質(zhì)材料[4-5]。已有報道顯示靜磁場能使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、形態(tài)發(fā)生改變，這可能是由于磁場引起了細(xì)胞骨架的改變[6-8]，而磁性附著體本身具有的靜磁場是否對牙周膜細(xì)胞骨架產(chǎn)生影響以及怎樣的影響是值得關(guān)注的問題。本研究采用細(xì)胞靜磁場加載裝置對體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞進(jìn)行靜磁場加載研究磁性附著體靜磁場對HPLCs 骨架影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

胎 牛 血 清（Hyclone，美 國）、DMEM 培 養(yǎng) 基（Gibco，美國）、鼠抗人角蛋白抗體、胰蛋白酶（Gibco，美國），TritonX-100（Rohm&Haas，美國）、Ⅰ型膠原酶（Sigma，美國）、鼠抗人波形絲蛋白抗體（Dako，丹麥）、激光掃描共聚焦顯微鏡（MRC1024ES型）、圖像分析軟件（LaserPix，MediaCybernetics，美國）、細(xì)胞核熒光標(biāo)記物（BOBO-3，MolecularProbes，美國）、聚合態(tài)肌動蛋白（F-actin）熒光標(biāo)記物（BODIPYFLphallacidin，MolecularProbes，美 國；BODYPY-Phaloidin，Roche，瑞士）、細(xì)胞靜磁場加載裝置，LSCM（MRC1024ES 型，BioRad，英國）。

1.2 方法

收集我院因阻生或正畸拔除的牙齒在無菌條件下將牙根面中1/3 的牙周膜組織刮下進(jìn)行HPLCs原代培養(yǎng)，將兩次消化后的細(xì)胞加入0.1%Ⅰ型膠原酶消化，加入DMEM 培養(yǎng)基（含200mL/L 胎牛血清），置于37℃的CO2孵箱中培養(yǎng)。進(jìn)行波形絲蛋白和細(xì)胞角蛋白染色，取生長良好的第5、6 代人HPLCs 用于實驗。細(xì)胞靜磁場加載：將培養(yǎng)好的HPLCs 分組進(jìn)行50mT、120mT 的靜磁場加載24、48、72h，而對照組細(xì)胞培養(yǎng)皿則放在靜置培養(yǎng)靜磁場加載裝置外的CO2孵箱中，其受到的磁場影響約為0.03 ～0.07mT。將所有組細(xì)胞爬片用PBS液洗、多聚甲醛固定、PBS 液清洗后滴加BODIPYFL phallacidin 標(biāo) 記F-actin、BOBO-3 熒 光 標(biāo) 記 物 標(biāo)記細(xì)胞核，滴加預(yù)加入10g/L 的牛血清白蛋白的BODYPY-Phaloidin，37℃孵育1h 后PBS 液清洗最后緩沖甘油封片。用激光掃描共聚焦顯微鏡以及圖像分析軟件測定分析細(xì)胞長寬比、面積以及細(xì)胞骨架蛋白的熒光強度并與對照組對比。

表1 靜磁場加載對細(xì)胞長寬比、面積的影響（）

表1 靜磁場加載對細(xì)胞長寬比、面積的影響（）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與24h 比較，bP ＜0.05；兩因素方差分析，CP ＜0.05

SMF細(xì)胞長寬比 細(xì)胞面積（pixel）時（2 4間h） 4.6對75照 ±組0.8 68 2.57 55 0±m(xù)0T.5 63 a 2.73 152±0 m0T.4 20 a 0.0 P0 3 247對54照±組9 8 62 197 5204m±T8 6 2 3 12 182705m±T 82 01 0 P.253 48 4.764±0.812 2.164±0.342a，b 1.804±0.843a，b 0.021 19649±6428 10049±8428a 7041±3543a 0.024 72 5.535±0.904 1.695±0.121a，b 1.402±0.424a，b 0.008 18654±3725 6654±3687a 5621±3231a 0.000 P 0.310 0.015 0.013 0.000C 0.631 0.061 0.213 0.001C

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 靜磁場加載對細(xì)胞長寬比、面積的影響

加載靜磁場72h 后，加載50mT 和120mT 靜磁場的細(xì)胞微絲的細(xì)胞面積均減小[F（4，241）=824.351，P ＜0.05]，且加載120mT 靜磁場的細(xì)胞微絲的細(xì)胞面積比加載50mT 靜磁場的細(xì)胞微絲的細(xì)胞面積小[F（2，9）=942.537，P ＜0.05]；隨加載時間和加載強度增加，細(xì)胞微絲骨架變短，細(xì)胞長寬比減小[F（4，241）=1021.205，P ＜0.05]。見表1。

2.2 不同強度靜磁場加載后熒光標(biāo)記的成骨細(xì)胞骨架蛋白的熒光強度

加載50mT、120mT 靜磁場24、48、72h，細(xì)胞核周圍成骨細(xì)胞骨架蛋白熒光強度均較對照組增強[F（4，241）=1103.672，P ＜0.05]，且受50mT 靜磁場加載的成骨細(xì)胞骨架蛋白的熒光最強[F（2，9）=1003.241，P ＜0.05]。見表2。

表2 不同強度靜磁場加載后熒光標(biāo)記的成骨細(xì)胞骨架蛋白的熒光強度（）

表2 不同強度靜磁場加載后熒光標(biāo)記的成骨細(xì)胞骨架蛋白的熒光強度（）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；50mT 與120mT 組間比較，bP＜0.05；兩因素方差分析，CP ＜0.05

SMF熒光強度時（2 4間h ） 24對.40照±組0.29 28.1 520±m(xù) T 0.20 a 28.10290±m(xù)0T.1 9 0.0 P 11 48 24.45±0.31 35.10±0.23a，b 31.04±0.21a 0.018 72 24.43±0.28 35.13±0.21a，b 29.68±0.19a 0.016 P 0.201 0.012 0.324 0.000C

3 討論

細(xì)胞骨架是維持細(xì)胞基本形態(tài)的重要結(jié)構(gòu)，它由微管、微絲和中間纖維構(gòu)成，其中微絲普遍存在于多種細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞形態(tài)維持、分裂與運動中起重要作用，是直接影響細(xì)胞的形狀的重要成分，它由肌動蛋白與肌動蛋白相關(guān)蛋白構(gòu)成，其中肌動蛋白可以較好地反映微絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化[9-10]。已有報道顯示靜磁場能使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、形態(tài)發(fā)生改變，這一改變可能是由于磁場引起了細(xì)胞骨架的改變有關(guān)，而磁性附著體是一種裝置利用磁性材料的磁力將修復(fù)體吸附到種植體或基牙上從而固位和穩(wěn)定修復(fù)體[6，11-15]，那么磁性附著體本身具有一定強度的靜磁場是否對牙周膜細(xì)胞骨架產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步研究證明。

本研究采用細(xì)胞靜磁場加載裝置對體外培養(yǎng)的HPLCs 進(jìn)行靜磁場加載觀察比較肌動蛋白長寬比、面積以及細(xì)胞骨架蛋白的熒光強度來研究磁性附著體靜磁場對HPLCs 骨架影響。結(jié)果顯示：加載靜磁場72h，加載50mT 和120mT 靜磁場的細(xì)胞微絲的細(xì)胞面積均減?。≒ ＜0.05），且加載120mT 靜磁場的細(xì)胞微絲的細(xì)胞面積比加載50mT 靜磁場的細(xì)胞微絲的細(xì)胞面積??；隨加載時間和強度增加，胞微絲骨架變短且細(xì)胞長寬比減?。≒ ＜0.05），這與胥春等[6]報道結(jié)果相似，提示靜磁場如果強度較高、暴露時間較長能對人牙周細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，應(yīng)謹(jǐn)慎使用。加載50mT、120mT 靜磁場24、48、72h，細(xì)胞核周圍成骨細(xì)胞骨架蛋白熒光強度均較對照組增強（P ＜0.05），且受50mT 靜磁場加載的成骨細(xì)胞骨架蛋白的熒光最強，這一結(jié)果與王勝國等[16]報道結(jié)果一致。以上結(jié)果說明一定強度的靜磁場能使HPLCs 細(xì)胞骨架發(fā)生一定程度的改建和重組。因此，在磁性附著體的設(shè)計和制造中也應(yīng)盡量避免磁場泄漏，使其最小化，此外在臨床操作時應(yīng)準(zhǔn)確將銜鐵與磁體對位，從而使靜磁場照射強度對牙周組織的影響降到最小。

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