譚 玲，王 亮，燕 紅，戴一凡，周邦煒，林巧文，鄭志永，張震宇，孫付保，*

(1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122; 2.山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100; 3.哈爾濱理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

纖維素酶的應(yīng)用非常廣泛，可用于輔助處理淀粉質(zhì)原料來(lái)生產(chǎn)飼料、酒精、果蔬汁和啤酒等。在果蔬汁的提取純化方面，纖維素酶能夠破壞植物細(xì)胞壁，增加果汁的產(chǎn)率，縮短生產(chǎn)時(shí)間，并且壓榨之后能使果漿部分或是完全液化。在啤酒釀造方面，能增加過(guò)濾速度，減少截留時(shí)間，降低粘度，達(dá)到節(jié)約能源的效果［1-2］。

另一方面，纖維素酶水解木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物燃料或者其它產(chǎn)物一直是生物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。木質(zhì)纖維素的利用主要包括預(yù)處理和酶解兩個(gè)步驟，其中預(yù)處理方法包括:稀硫酸、稀堿、熱水、汽爆、液氨、生石灰、有機(jī)溶劑和離子液等［3-4］。在前期工作中，本實(shí)驗(yàn)室建立了一種高沸點(diǎn)有機(jī)溶劑預(yù)處理—常溫甘油自催化預(yù)處理，該方法能通過(guò)解離纖維質(zhì)復(fù)雜的組成結(jié)構(gòu)而提高酶解效率［5］。在酶解方面，纖維素酶是影響該過(guò)程成本的關(guān)鍵因素之一［6-7］，于是國(guó)內(nèi)外許多研究者開(kāi)展纖維素酶制劑應(yīng)用酶解的工作。江新德等［8］和劉俊［9］分別探討了Celluclast 1.5L水解園藝廢棄物和舊紙板紙漿的特性。趙鵬飛等發(fā)現(xiàn)CTec2能夠高效酶解乳酸預(yù)浸漬和蒸汽爆破預(yù)處理的小麥秸稈，以及磷酸預(yù)浸蒸汽爆破玉米秸稈［10-11］，并提高基質(zhì)同步糖化發(fā)酵的產(chǎn)量［12-13］，該研究顯示CTec2能夠水解不同來(lái)源的木質(zhì)纖維素，具有較好的基質(zhì)適應(yīng)性。然而，這些研究都屬于CTec2的直接利用，有待開(kāi)展該酶以及與其它纖維素酶相比較的系統(tǒng)研究。因此，本文以常壓甘油自催化預(yù)處理麥草作為基質(zhì)，通過(guò)與其它三種商業(yè)纖維素酶相比較，考察CTec2水解效果、酶活特征和高濃水解以及添加劑對(duì)CTec2高濃度基質(zhì)酶解的影響，詳細(xì)研究CTec2對(duì)天然木質(zhì)纖維素基質(zhì)的水解特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

風(fēng)干小麥秸稈 來(lái)自河南南陽(yáng)，剪成2cm左右的小段，60℃烘干到恒重，儲(chǔ)存于實(shí)驗(yàn)塑料袋中備用;工業(yè)甘油 購(gòu)自河北省衡水京華化工有限公司，濃度為95%，用于預(yù)處理時(shí)稀釋到70%;纖維素酶Cellic CTec2、Celluclast 1.5 L由諾維信(中國(guó))投資有限公司饋贈(zèng)，纖維素酶GC220和Spezyme-CP 購(gòu)自無(wú)錫杰能科生物工程有限公司。

加熱套 上海勒頓實(shí)業(yè)ZNHW(500m L)加熱套;酶標(biāo)儀 美國(guó)，美谷分子SpectraMax Plus384。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 常壓甘油自催化預(yù)處理 取10g烘干的麥草于圓底燒瓶中，加入200g濃度為70%的甘油水溶液，用加熱套加熱到220℃后保持3h。自然冷卻到120～130℃，緩緩加入150m L去離子水并不斷攪拌。1號(hào)砂芯漏斗趁熱過(guò)濾，用40%的熱甘油水溶液洗兩次后再用去離子水洗兩次。處理后的麥草分為兩部分，一部分60℃烘干到恒重用來(lái)測(cè)量含水量，另一部分冷凍保藏用于后續(xù)酶解［14］。

1.2.2 預(yù)處理麥草的酶解 基質(zhì)濃度為2%時(shí)，稱(chēng)取相當(dāng)于0.3g干重的常壓甘油自催化預(yù)處理麥草濕基于150mL三角瓶中，分別按每克纖維多糖添加15mg酶蛋白(12.5FPU)加入纖維素酶 CTec2、Celluclast 1.5L、GC220和Spezyme-CP，然后補(bǔ)加緩沖溶液到15g，放置溫度50℃和轉(zhuǎn)速120r/min水浴搖床上進(jìn)行酶解。在24、48和72h時(shí)分別取樣，測(cè)量酶解率。當(dāng)基質(zhì)濃度為15%時(shí)，稱(chēng)取相當(dāng)于2.25g干重的基質(zhì)和相應(yīng)酶載量的CTec2，其余操作同上。本實(shí)驗(yàn)均為2個(gè)重復(fù)。

1.2.3 纖維素酶之間的協(xié)同作用 四種纖維素酶CTec2、GC220、Celluclast 1.5L和Spezyme-CP按酶蛋白用量1∶1兩兩復(fù)合，按總酶載量為15mg/g纖維多糖以2%常壓甘油自催化預(yù)處理麥草進(jìn)行酶解，考察四種纖維素酶之間的協(xié)同作用。

1.2.4 添加劑對(duì)酶解的影響 添加劑種類(lèi)的選擇:配成底物濃度為15%，酶載量為8mg/g的酶解體系，然后按0.05g/g基質(zhì)分別加入PEG系列(PEG1000，PEG2000，PEG4000，PEG6000，PEG10000)、吐溫系列(吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80)和BSA。在選擇添加劑濃度時(shí)，在上述酶解體系中分別加入不同濃度(0.001，0.025，0.05，0.1g/g)PEG10000、吐溫20和BSA進(jìn)行酶解以選擇適宜的添加劑濃度。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 麥草組分測(cè)定方法 麥草的纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素的含量參照國(guó)際能源部實(shí)驗(yàn)室［15-16］和華南理工大學(xué)［17-18］的方法進(jìn)行測(cè)定。

表1 常壓甘油自催化預(yù)處理前后麥草的主要組成變化Table1 Main composition ofwheat straw before and after atmospheric glycerol pretreatment

1.3.2 纖維素酶蛋白含量 根據(jù)李紅武［20］和蔡紅［21］所用的茚三酮比色法測(cè)定酶蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 還原糖測(cè)定方法 還原糖測(cè)定用DNS法［22］，根據(jù)姚明靜的方法［23］加以改進(jìn)。具體為:吸光值的測(cè)定改用酶標(biāo)儀，保持同批次測(cè)量結(jié)果一致性的同時(shí)大大節(jié)省了工作量。

1.3.4 酶活測(cè)定方法 濾紙酶活(FPA)根據(jù)國(guó)際理論應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)推薦的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定［23］。β-葡萄糖苷酶酶活(BG)和CMC酶活的測(cè)定根據(jù)Nieves方法進(jìn)行測(cè)定［24］。酶活定義:酶于 50℃和pH4.8條件下，每分鐘水解0.5000g標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)生成1μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位［25］。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析方法 酶解率=［(15 W酶解后)/ρ上清］C測(cè)/［C總2.25 ×1.111］

式中:W酶解后:酶解液中的基質(zhì)干重，ρ上清:酶解液上清的密度，C測(cè):酶解液中還原糖濃度，C總:預(yù)處理麥草中的纖維多糖濃度(0.8014g纖維多糖/g基質(zhì))。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Excel軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾種代表性商業(yè)纖維素酶制劑的比較

為了比較 CTec2和其它三種商業(yè)纖維素酶(Celluclast 1.5L、GC220和Spezyme-CP)水解常溫甘油自催化預(yù)處理麥草的酶解率，本實(shí)驗(yàn)在相同濾紙酶活(12.5U/g纖維多糖)和相同蛋白載量(15mg/g纖維多糖)情況下，用四種商業(yè)纖維素酶分別酶解了2%預(yù)處理麥草。如圖1所示，四種商業(yè)纖維素酶水解預(yù)處理麥草產(chǎn)糖量在48h之前隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，48h之后水解率沒(méi)有明顯變化。由圖1a可知相同濾紙酶活條件下，CTec2的水解率明顯高于其它三種纖維素酶，在48h達(dá)到78.4%，為最高水解率，繼續(xù)往后水解，基質(zhì)水解率沒(méi)有提高。CP的水解效果次之，1.5L和GC220的水解率較差，水解48h在54%左右。圖1b顯示，在相同酶蛋白載量情況下，CTec2在48h時(shí)酶解效果明顯好于其它三種纖維素酶，高達(dá)71.5%，但其它三種纖維素酶比較低，在48h時(shí)不到40%。這些數(shù)據(jù)表明，纖維素酶制劑Ctec2更適用于常壓甘油自催化預(yù)處理麥草的酶解，在相同濾紙酶活時(shí)該酶水解常壓甘油自催化預(yù)處理麥草的酶解率高，可能是該酶制劑中存在一些非纖維素酶蛋白，它們?cè)谠撁杆鈺r(shí)起著積極作用，也可能是該酶的纖維素酶蛋白之間存在較好的協(xié)同作用。

圖1 四種商業(yè)纖維素酶水解常壓甘油自催化預(yù)處理麥草的比較Fig.1 Comparison of four cellluase preparations acting on atmospheric glycerol pretreated wheat straw at an equal loading

2.2 商業(yè)纖維素酶制劑的酶活分析

上面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在相同濾紙酶活或蛋白含量條件下CTec2酶解效果遠(yuǎn)高于其它三種商業(yè)纖維素酶。為了探究其原因，我們對(duì)這四種商業(yè)纖維素酶一些酶活進(jìn)行了測(cè)定。表2為四種商業(yè)纖維素酶CTec2、GC220、Celluclast 1.5 L和 Spezyme-CP的CMC酶活、β-葡萄糖苷酶活力、濾紙酶活、蛋白含量以及比活力。由表2可知，四種商業(yè)纖維素酶中，單位體積的CTec2蛋白含量最高，達(dá)到197.08 mg/m L。單位CTec2蛋白的濾紙酶活和β-葡萄糖苷酶酶活和CMC酶活分別為0.62、0.73、11.02U/mg，其中濾紙比酶活和BG比酶活是四種商業(yè)纖維素酶中最高的。值得關(guān)注的是Ctec2的CMC比酶活力不高，結(jié)合前面這些酶對(duì)天然木質(zhì)纖維素基質(zhì)水解來(lái)看，合理纖維素酶蛋白種類(lèi)和比例才可能是木質(zhì)纖維素基質(zhì)高效水解的關(guān)鍵，這些酶蛋白之間通過(guò)協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)了整個(gè)纖維素酶制劑對(duì)纖維基質(zhì)的高效水解，這可能是上面Ctec2在甘油預(yù)處理纖維基質(zhì)上表現(xiàn)出優(yōu)于其它三種酶制劑水解性能的重要原因。

表2 各種商業(yè)纖維素酶的酶活分析Table2 Specific activity and protein loading of four commercial celluclases

2.3 商業(yè)纖維素酶之間的協(xié)同性

圖2 四種商業(yè)纖維素酶兩兩之間的協(xié)同作用Fig.2 Synergy of four different commercial cellulases

據(jù)報(bào)道，不同商業(yè)纖維素酶按照1∶1比例復(fù)合后能夠提高酶水解基質(zhì)的效率［26］，為此本實(shí)驗(yàn)把這四種商業(yè)纖維素酶兩兩復(fù)合，考察復(fù)合酶水解甘油預(yù)處理基質(zhì)的酶解率。圖2為CTec2、GC220、Celluclast 1.5LSpezyme-CP在總酶載量為15mg/g葡聚糖的條件下按酶蛋白量1∶1兩兩復(fù)合酶解2%基質(zhì)濃度的酶解。三組含有CTec2的纖維素酶組合，其水解率明顯高于其它三組，但是都低于相同蛋白含量的CTec2酶解率。說(shuō)明CTec2酶解率比另外三個(gè)纖維素酶好，而且與其它三種纖維素酶制劑沒(méi)有協(xié)同性，這可能是因?yàn)镃Tec2中各種單酶的比例已經(jīng)是四種商業(yè)纖維素酶中最佳的，再與其它纖維素酶混合打亂了其中各種單酶的比例，從而不能更好的協(xié)同酶解木質(zhì)纖維素。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示在相同酶載量時(shí)，GC220、CP和1.5L兩兩之間復(fù)合水解的酶解率也低于它們單一的酶解率，這表明商業(yè)纖維素酶在制備時(shí)可能已考慮到了關(guān)鍵纖維素酶蛋白組分間的協(xié)同性，早期商業(yè)纖維素酶制劑的酶解能力不如Ctec2，這些酶制劑組分的合理配比可能不是重要因素，主要可能是由于這些酶制劑中與木質(zhì)纖維素水解密切相關(guān)的關(guān)鍵酶蛋白含量(EG、CBH和BG;EX和BX)不夠，提高這些關(guān)鍵性酶蛋白組分在整個(gè)纖維素酶制劑中比例可能是提高酶制劑水解潛能的關(guān)鍵途徑［27］。

2.4 CTec2酶解高濃基質(zhì)的特性

圖3 酶載量對(duì)高濃基質(zhì)水解的影響Fig.3 Effect of enzyme loading on high consistency hydrolysis of lignocellulose

纖維素酶在髙基質(zhì)濃度條件下的酶解(高濃酶解)具有以下優(yōu)點(diǎn):獲得更高的糖濃度從而增加產(chǎn)物含量;減少工業(yè)生產(chǎn)中能量和水的消耗;降低后續(xù)水解液中產(chǎn)品濃縮和提純的運(yùn)行成本［28］。前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CTec2在低基質(zhì)濃度(2%)的條件下能高效水解常壓甘油自催化預(yù)處理麥草，48h酶解率達(dá)到71.5%。為此，本實(shí)驗(yàn)探究了CTec2對(duì)10%、15%和20%高基質(zhì)濃度常壓甘油預(yù)處理麥草酶解特性。從圖3可以看出:相同的酶載量時(shí)，基質(zhì)液化時(shí)間隨著濃度增加而延長(zhǎng)，酶解率隨著基質(zhì)濃度的增加而減少;相同基質(zhì)濃度時(shí)，酶解率隨著酶載量的增加而增加。圖3a顯示，在10%濃度基質(zhì)上酶載量為10、15、20mg/g纖維多糖時(shí)對(duì)應(yīng)的72h酶解率分別達(dá)到58.9%、61.7%和62.9%，相對(duì)應(yīng)地，其它三種酶表現(xiàn)為未液化或僅部分液化(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)基質(zhì)濃度為20%時(shí)預(yù)處理麥草水解率明顯降低，酶載量20mg/g纖維多糖時(shí)的72h酶解率僅為44.80%，比10%時(shí)低18.11%。這可能是因?yàn)樵谶^(guò)高的基質(zhì)濃度導(dǎo)致基質(zhì)粘度增加，產(chǎn)生流體力學(xué)問(wèn)題，導(dǎo)致酶和底物的接觸(吸附解吸)變得困難，從而影響了纖維素酶的水解效率［29］。由于在基質(zhì)濃度為10%時(shí)，基質(zhì)很容易液化(24h內(nèi)液化)，而基質(zhì)濃度為20%時(shí)，基質(zhì)很難液化(48h都不液化)，故本實(shí)驗(yàn)在15%基質(zhì)濃度下增加了幾個(gè)酶載量的探索。實(shí)驗(yàn)表明，在15%基質(zhì)濃度水平，隨著酶載量從5mg/g纖維多糖增加到20mg/g纖維多糖，72h預(yù)處理麥草的酶解率從34.8%增加到了64.5%。酶載量為8mg/g纖維多糖時(shí)，72h酶解率達(dá)到39.06%，且36h時(shí)基質(zhì)已經(jīng)完全液化，有利于后續(xù)時(shí)間中CTec2和纖維素的接觸?？紤]高基質(zhì)濃度和低酶載量的問(wèn)題，我們選取基質(zhì)濃度15%、酶載量8mg/g作為后面了解CTec2水解高濃基質(zhì)特性的條件。

2.5 添加劑對(duì)CTec2酶解的影響

已有文獻(xiàn)報(bào)道，高分子聚合物、表面活性劑和非催化作用的蛋白質(zhì)等能夠極大提高木質(zhì)纖維素基質(zhì)酶解的水解率，降低纖維素酶的載量［30-31］。其中吐溫系列和聚乙二醇系列是實(shí)驗(yàn)室最常用的非離子型表面活性劑。因此，本實(shí)驗(yàn)探究了吐溫系列、PEG系列和BSA對(duì)CTec2酶解高濃基質(zhì)的影響。

2.5.1 添加劑種類(lèi)的影響 圖4為不同種類(lèi)的添加劑對(duì)CTec2在酶載量8mg/g葡聚糖時(shí)水解15%基質(zhì)濃度常壓甘油自催化麥草的影響。從圖中可以看出，PEG的添加影響最大，比不添加任何添加劑時(shí)提高了50%以上，但PEG的不同分子量對(duì)酶解影響沒(méi)有明顯差異。Kristensen用不同分子量PEG作添加劑，發(fā)現(xiàn)隨著分子量的增加，纖維素轉(zhuǎn)化率稍有提高［32-33］，也和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。PEG的作用機(jī)制主要是依靠疏水作用結(jié)合在木質(zhì)纖維素中木質(zhì)素上，減少木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的無(wú)效吸附，從而提高了纖維素酶的有效吸附，最終提高了酶解率［34］。

圖4 各種添加劑對(duì)酶解的影響Fig.4 Effect of various additives on enzymatic hydrolysis ofwheat straw

同時(shí)，通過(guò)添加吐溫系列于水解體系中發(fā)現(xiàn)，Tween20在添加量0.05g/g基質(zhì)時(shí)基質(zhì)的72h酶解率提高到55.6%，比不添加時(shí)提高了42.5%。W illiam也指出，吐溫在高基質(zhì)濃度(玉米秸稈)下更能提高基質(zhì)的酶解率，其機(jī)制是吐溫可以防止酶的熱失活、破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)［35］。Eriksson研究認(rèn)為T(mén)ween20能夠降低酶在木質(zhì)纖維表面的吸附，大約從90%降低為80%，而且其還能夠提高纖維素酶的穩(wěn)定性［36］。

按0.05g/g基質(zhì)添加BSA使得基質(zhì)72h水解率達(dá)到54.0%，比未添加的提高了38.3%，相似的結(jié)果也被其他研究者報(bào)道。王新明在用纖維素酶(40U/g秸稈)水解稀硫酸和氫氧化鈉處理的麥秸時(shí)，發(fā)現(xiàn)添加牛血清蛋白0.04g反應(yīng)48h時(shí)，還原糖得率分別提高30%和22%［37］。Brethauer發(fā)現(xiàn)添加BSA使稀酸預(yù)處理玉米秸稈72h水解率增加了26%，認(rèn)為BSA有助于纖維素酶水解的機(jī)制是減少纖維素酶失活、降低纖維素結(jié)晶度和基質(zhì)顆粒大?。?8］。還有些研究者也認(rèn)為，BSA通過(guò)吸附在木質(zhì)素上阻止了木質(zhì)素在這些位點(diǎn)上對(duì)纖維素酶的無(wú)效吸附［39］，BSA也能激活和協(xié)調(diào)纖維素酶復(fù)合酶系，加速酶在基質(zhì)上的吸附和解吸［37］。

圖5 添加劑濃度(g/g基質(zhì))對(duì)CTec2酶解的影響Fig.5 Effect of additive concentration(g/g substrate) on hydrolysis of glycerol pretreated wheat straw with Ctec2

2.5.2 添加劑濃度的影響 既然PEG10000、吐溫20和BSA均能提高纖維素酶酶解，本實(shí)驗(yàn)就對(duì)這些添加劑使用濃度進(jìn)行了初步選擇。由圖5所示，三種添加劑濃度低于0.05g/g基質(zhì)時(shí)，酶解率隨著添加劑濃度的增加而升高，超過(guò)0.05g/g基質(zhì)之后，酶解率變化不明顯，所以本實(shí)驗(yàn)中選取0.05g/g基質(zhì)為三種添加劑的適宜添加量，72h的酶解率分別提高了55.3%(PEG10000)、42.5%(吐溫 20)和 38.3% (BSA)。初步分析認(rèn)為三種添加劑通過(guò)吸附到木質(zhì)素表面防止了酶與木質(zhì)素結(jié)合引起失活，提高了纖維素酶有效利用率;但是當(dāng)添加劑濃度進(jìn)一步增大時(shí)木質(zhì)素表面的結(jié)合位點(diǎn)基本被飽和，故進(jìn)一步增加添加劑也不會(huì)提高酶解的糖化率［40］。

3 結(jié)論

3.1 與早期的商業(yè)纖維素酶制劑GC220、CP和1.5L相比，Ctec2更適用于常壓甘油自催化預(yù)處理木質(zhì)纖維素基質(zhì)水解。像其它三種酶制劑一樣，該酶制劑組成及其比例是相對(duì)合適的，不但它的蛋白含量高，而且酶蛋白比活力很高，這可能是它優(yōu)于其它三種酶的根本原因。

3.2 與其它三種商業(yè)酶制劑相比，Ctec2的顯著優(yōu)勢(shì)是酶載量低于10mg/g(纖維多糖)時(shí)48h內(nèi)能使10%～15%濃度基質(zhì)液化，15%基質(zhì)濃度(酶載量8mg/g纖維多糖)時(shí)72h酶解率將近40%，而相同條件下的其它三種酶幾乎不能使基質(zhì)液化。Ctec2適用于木質(zhì)纖維素基質(zhì)的高濃水解，是一款可以應(yīng)用于纖維素乙醇工業(yè)的新型酶制劑。

3.3 Ctec2像其它纖維素酶制劑一樣，添加一些輔助因子，如吐溫、PEG和BSA，能顯著提高其木質(zhì)纖維素基質(zhì)水解率。這些添加劑價(jià)格相對(duì)便宜，建議在CTec2的工業(yè)應(yīng)用中適當(dāng)添加相應(yīng)的添加劑。

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