顧超逸，孫 裴，施 雷

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

安徽省豬流行性腹瀉病毒的ORF3基因序列分析

顧超逸，孫 裴，施 雷

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

【目的】 研究安徽地區(qū)豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)ORF3基因序列特征?！痉椒ā?于2012-2013年，從安徽省合肥、肥東、肥西、滁州、亳州、阜陽、馬鞍山、蚌埠、宿州、巢湖、六安、淮南、宣城和淮北地區(qū)的19個不同豬場采集93份病料，采用RT-PCR方法對PEDV ORF3基因進行擴增，測序后進行序列分析，并與韓國、歐洲及中國其他省份PEDV毒株進行同源性比較，并構(gòu)建遺傳進化樹?！窘Y(jié)果】 在93份病料中，自20份病料中獲得的PEDVORF3基因開放閱讀框全長為810 bp，編碼224個氨基酸，較多的基因位點發(fā)生了突變，沒有缺失和插入。安徽省PEDV毒株之間的同源性為96.7%～100.0%，與歐洲株同源性為94.9%～97.0%，與韓國株同源性分別為96.3%～98.7%，與中國其他省份分離株的同源性為95.9%～100.0%。【結(jié)論】 安徽地區(qū)PEDVORF3基因與韓國株親緣關(guān)系較近，而與歐洲株親緣關(guān)系較遠。

豬流行性腹瀉病毒；ORF3基因；基因分析；安徽

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)的病原是豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)，PEDV屬于尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)抗原Ⅰ群的成員，是有囊膜的不分節(jié)段的單鏈正股RNA病毒，目前僅見1個血清型[1]。PEDV與同屬的人類冠狀病毒229E、傳染性胃腸炎病毒和貓傳染性腹膜炎病毒親緣關(guān)系較近[2]。PEDV基因組全長約28 033 bp (PEDV CV777株)，5′端有帽子結(jié)構(gòu),3′端有一個Poly(A)尾。PEDV基因組內(nèi)有6個主要的開放閱讀框，編碼典型的冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白，從5′→3′端依次為編碼復(fù)制酶多聚蛋白(lab)、纖突蛋白(S)、ORF3蛋白、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)的基因[3-4]。

PEDV ORF3蛋白為224個氨基酸的多肽，分子質(zhì)量為25.3 ku，是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，其位置在第116-784個核苷酸之間[5-6]。2007年P(guān)ark等對DR13強毒株、Vero細胞傳100代致弱株及12株野毒株的ORF3基因序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)Vero細胞傳100代致弱株與其他強毒株相比出現(xiàn)了51個核苷酸的缺失，為區(qū)分PEDV強弱毒株提供了依據(jù)[7-9]。ORF3蛋白是PEDV基因組編碼的惟一的一個輔助蛋白。研究表明，ORF3基因編碼一個離子通道，通過對強弱毒株之間的比較分析可知，該通道與病毒毒力的大小密切相關(guān)[10-11]。

1971年，PED首次在歐洲被發(fā)現(xiàn)，臨床癥狀與傳染性胃腸炎相似，發(fā)病率較高，死亡率較低。自2010-10開始，PED在我國大面積流行，哺乳仔豬死亡率高達100%。安徽省位于華中、華南腹瀉嚴重地區(qū)的交匯處，在該病的流行中起了重要的作用。本研究對安徽地區(qū)PEDVORF3基因進行分析，旨在為豬流行性腹瀉的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料的采集與處理

于2012-2013年采集安徽地區(qū)合肥、肥東、肥西、亳州、阜陽、滁州、馬鞍山、蚌埠、宿州、巢湖、六安、淮南、宣城和淮北地區(qū)的19個不同豬場內(nèi)腹瀉仔豬的腸內(nèi)容物、十二指腸、空腸、回腸及腸系膜淋巴結(jié)的混合樣品共93份。其中蚌埠地區(qū)2次采樣為同一豬場，其他重復(fù)采樣地區(qū)均為不同豬場。

將采集的病料放入研磨器內(nèi)，以1 g加10 mL的比例加入無菌PBS (100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，pH 7.2)，研磨成組織勻漿,反復(fù)凍融4次，12 000 r/min離心10 min，無菌吸取上清液，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試 劑

總RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、2×GoTaqMaster Green Mix、M-Mlv反轉(zhuǎn)錄酶和5× first strand buffer購自Tigen公司， DEPC原液購自上海生物工程有限公司。

1.3 引 物

參考GenBank上已公布的PEDV CV777株 (GenBank登錄號AF353511)的基因序列設(shè)計一對引物用于擴增ORF3基因。引物由上海生物工程有限公司合成。上游引物：5′-TCCTAGACTTCAA-CCTTACG-3′，下游引物：5′-GGTGACAAGTGAA-GCACAGA-3′。預(yù)期擴增的基因片段約為810 bp。

1.4 ORF3基因的擴增

取一無菌離心管，加入冷凍保存?zhèn)溆玫牟《疽?00 μL，按總RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA，用1.3的下游引物作為反轉(zhuǎn)錄的引物，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為：dNTP 3 μL(2.5 mol/mL)，引物1 μL(10 pmol/μL),5×first strand buffer 5 μL，RNA模板6 μL，補充無菌雙蒸水至總體積為20 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA置于-20 ℃下備用。

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系為2×GoTaqMaster Green MIx 25 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各2 μL,cDNA模板2 μL，加入無菌雙蒸水補至總體積為50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。陰性對照為雙蒸水，陽性對照為PEDV弱毒疫苗。

1.5 ORF3基因序列分析

取PCR擴增的產(chǎn)物20 μL,在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)膠回收后送往上海生物工程工有限公司測序，用DNASTAR軟件比較其與其他PEDV毒株序列的同源性，并繪制遺傳進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV ORF3基因片段的RT-PCR擴增鑒定

93份病料中，有20份經(jīng)RT-PCR擴增獲得的PEDVORF3基因開放閱讀框全長為810 bp (圖1)，編碼224個氨基酸。

圖1 PEDV ORF3基因的RT-PCR擴增結(jié)果
1.陽性病料；2.陽性對照;3.陰性對照;4.DNA Marker DL2000
Fig.1 Electrophoresis pattern of RT-PCR products of ORF3 gene
1.PCR product of ORF3 gene;2.Positive control;3.Negative control；4.DNA Mark DL2000

2.2 PEDV ORF3基因序列及編碼氨基酸序列分析

對20株P(guān)EDVORF3進行測序，并將測序結(jié)果提交至GenBank，獲得的登錄號見表1。20株P(guān)EDVORF3均有完整的開放閱讀框，由810個核苷酸組成，編碼224個氨基酸。與參考株P(guān)EDVCV777基因序列相比，20株安徽株于497位發(fā)生A→G突變，62、393位發(fā)生T→C突變，160、235、301位發(fā)生G→A突變，243、450位發(fā)生C→T突變。AHLA、AHFR、AHLX、AHBB、2013AHBB株于208位發(fā)生A→G突變，555位發(fā)生A→C突變，39、74、318位發(fā)生T→C突變，108位發(fā)生T→G突變，99位發(fā)生C→T突變，135位發(fā)生G→C突變。2013AHLA、2013AHHB株于24位發(fā)生C→T突變，206位發(fā)生A→G突變。

將推導(dǎo)的氨基酸序列與PEDV CV777相比，20株安徽株于21位發(fā)生V→I突變，54、79位發(fā)生V→I突變，92位發(fā)生L→F突變，101位發(fā)生A→T突變，166位發(fā)生N→S突變，182位發(fā)生H→Q突變。AHLA、AHFR、AHLX、AHBB、2013AHBB株于25位發(fā)生L→S突變，70位發(fā)生I→V突變，88位發(fā)生Y→H突變，107位發(fā)生C→F突變。2013AHLA、2013AHHB株于69位發(fā)生Y→C突變，145位發(fā)生V→A突變。

2.3 PEDV毒株的ORF3基因同源性分析

將20株安徽地區(qū)PEDV毒株與比利時Br/87(GenBank登錄號：Z24733)，英國CV777株(GenBank登錄號：AF353511)，韓國株DR13(GenBank登錄號：EU054930)、VF131(GenBank登錄號：EU537444)、Chinju99(GenBank登錄號：EU792474)、PFF188(GenBank登錄號：HQ537445)，中國株JSYC2012(GenBank登錄號：KC161199)、JSTS2012(GenBank登錄號：KC161198)、AJ1102(GenBank登錄號：JX188454)、CHGD-1(GenBank登錄號：JN980697)ORF3基因序列同源性進行比較，結(jié)果見表2。由表2可知，安徽地區(qū)PEDV株之間的同源性為96.7%～100.0%，與歐洲株同源性為94.9%～97.0%，與韓國株同源性為96.3%～98.7%，與中國其他省份分離株的同源性為95.9%～100.0%。2012年安徽地區(qū)PEDV毒株中出現(xiàn)了較多相同的ORF3基因序列，其中AHHN、AHSZ、AHSX、AHGD、AHFX、AHYSORF3基因序列同源性為100.0%。2013年安徽地區(qū)PEDV毒株之間ORF3基因的同源性下降，出現(xiàn)相同基因序列毒株的比例明顯降低。

注：1～20號依次為安徽地區(qū)毒株AHHN、AHSZ、AHSX、AHFR、AHFD、AHLA、AHFY、AHLX、AHBB、AHGD、AHFX、AHYS、2013AHLA、2013AHCH、2013AHLX、2013AHHB、2013AHDY、2013AHMAS、2013AHFD和2013AHBB;21.Br/87;22.CV777;23.DR13;24.VF131;25.Chinju99;26.PFF188;27.JSYC2012;28.JSTS2012;29.AJ1102;30.CHGD-1。

Note:1-20:ORF3 gene PCR products of Anhui strains:AHHN,AHSZ,AHSX,AHFR,AHFD,AHLA,AHFY,AHLX,AHBB,AHGD,AHFX,AHYS,2013AHLA,2013AHCH,2013AHLX,2013AHHB,2013AHDY,2013AHMAS,2013AHFD and 2013AHBB;21.Br/87;22.CV777;23.DR13;24.VF131;25.Chinju99;26.PFF188;27.JSYC2012;28.JSTS2012;29.AJ1102;30.CHGD-1.

2.4 PEDV ORF3遺傳進化分析

基于ORF3基因序列的PEDV遺傳進化分析結(jié)果見圖2。

圖2 基于ORF3基因序列的安徽PEDV株與其他地區(qū)毒株的遺傳進化樹
Fig.2 Phylogenetic analyses based on the nucleotide sequences ofORF3 gene from Anhui and other areas

圖2顯示，本試驗將30株P(guān)EDV毒株可以分為2大類群。其中20株P(guān)EDV安徽株、韓國株及我國其他省份毒株組成G1類群，歐洲株CV777和Br/87組成G2類群。其中G1類群又分為G1a和G1b子群，G1a子群由8株2012年安徽株和7株2013年安徽株組成，同屬該子群的還有江蘇株(JSTS2012、JSYC2012)和韓國株(PF188、Chinju99、DR13、VF131)；4株2012年安徽株、1株2013年安徽株、武漢株(AJ1102)、廣東株(CHGD-1)組成了G1b子群。

3 討 論

PED在1971年首次報道于歐洲，我國在1976有感染該病的報道[12]。該病以豬的水樣腹瀉、脫水以及哺乳仔豬的高死亡率為特征，常見由PEDV與傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒的混合感染[13-14]。本研究通過對安徽地區(qū)19個地區(qū)豬場的93份病料進行RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)PEDV與輪狀病毒的混合感染僅1例，與傳染性胃腸炎病毒的混合感染有2例。2009年，韓國首次報道了由于PEDV變異毒株引起該國PED的爆發(fā)。2010年，PED在我國東南沿海地區(qū)大流行，對我國生豬產(chǎn)業(yè)造成了災(zāi)難性的打擊[15]。2011年，Chen等[16]首次公布了PEDV變異株CH/FJND/-03/2011的全基因組序列，隨后不斷有變異毒株的基因組序列被報道。本研究中，2012年P(guān)EDV安徽株ORF3基因之間同源性較高，出現(xiàn)多個相同序列；而2013年P(guān)EDV安徽株ORF3基因之間同源性普遍下降，ORF3基因序列完全相同的毒株明顯減少。基于ORF3基因的遺傳分析顯示，安徽地區(qū)PEDV毒株與歐洲毒株遺傳關(guān)系較遠，與韓國和中國毒株遺傳關(guān)系較近；15株P(guān)EDV安徽株與江蘇株處于同一進化分支，這可能與兩省地理位置臨近，存在生豬交易有關(guān)?；贠RF3基因的分析，推測PEDV在安徽地區(qū)流行的過程中適應(yīng)了環(huán)境，在選擇性壓力下發(fā)生了一定的變異。本試驗分析了安徽地區(qū)PEDV毒株ORF3基因的序列特點，這對PEDV的深入研究有一定的參考價值。

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Sequence analysis ofORF3 gene of porcine epidemic diarrhea virus in Anhui Province

GU Chao-yi,SUN Pei,SHI Lei

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China)

【Objective】 This study aimed to investigate sequence features of ORF3 gene of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in Anhui province.【Method】 A total of 93 samples were collected from 19 different farms in Hefei,Bozhou,Fuyang,Maanshan,Bengbu,Suzhou,Caohu,Lu’an,Huainan,Xuncheng,and Huaibei in Anhui during 2012-2013.RT-PCR method was used for gene amplification and nucleotide sequences were analyzed after being sequenced.The results were compared with strains from other areas and phylogenetic tree was constructed.【Result】 20ORF3 genes out of 93 samples from Anhui had the open reading frame of 810 bp,encoding 224 amino acids.A large number of mutations occurred.The homology ofORF3 gene in Anhui PEDV were 96.7%-100.0%.The homology of ORF3 gene compared with European,Korea and other China strains were 94.9%-97.0%,96.3%-98.7% and 95.9%-100.0%,respectively.【Conclusion】ORF3 genes of Anhui isolates were genetically close to PEDV Korea strains while distantly related to European strains.

pig’s porcine epidemic diarrhea virus;ORF3 gene;genetic analysis;Ahhui Province

2013-10-22

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助項目(CARS-36-生豬)；安徽省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資金資助項目

顧超逸(1988-)，男，江蘇南通人，在讀碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail：570525345@qq.com

孫 裴(1979-)，男，安徽合肥人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。 E-mail：sunpei1979@126.com

時間:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.016

S852.65+1

A

1671-9387(2015)02-0001-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.016.html