李春杰，王麗芳，潘鳳娟，許艷麗

(中國科學院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)院重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081)

預處理方式對昆蟲病原線蟲冷凍存活的影響

李春杰，王麗芳，潘鳳娟，許艷麗

(中國科學院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)院重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081)

【目的】 探討提高昆蟲病原線蟲冷凍存活能力的方法，以改進昆蟲病原線蟲儲存技術。【方法】 以我國高寒地區(qū)分離、篩選出的高致病力昆蟲病原線蟲Heterorhabditisbacteriophora-HBN(HBN，45°45′N)和從美國引進的同種不同品系昆蟲病原線蟲H.bacteriophora-NJ(NJ，40°13′N)為研究對象，在實驗室條件下研究了不同預處理方式對2個品系線蟲冷凍存活率的影響?！窘Y果】 HBN經(jīng)過25 ℃ 7 d、10 ℃ 7 d、4 ℃ 7 d、25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d和25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d的預處理后，于-4 ℃冷凍5 d時的存活率為86.1%～95.2%，顯著高于直接冷凍法(25 ℃ 0 d)的存活率17.7%，而NJ經(jīng)25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d的預處理后，于-4 ℃冷凍5 d時的存活率為83.0%，顯著高于其他預處理(2.2%～58.5%)?！窘Y論】 適當?shù)念A處理可提高2個品系線蟲的冷凍存活率，但生活在不同地理緯度的同種線蟲(HBN和NJ)適于不同的馴化方式。

昆蟲病原線蟲；預處理；低溫馴化；冷凍儲存；存活率

昆蟲病原線蟲(Entomopathogenic nematode，EPN)是指體內(nèi)攜帶具有病原性的共生細菌，并能引起昆蟲致病的一類寄生性線蟲，它是昆蟲的重要天敵類群，已經(jīng)成功用于防治200余種害蟲[1]，且這種生物殺蟲劑具有廣闊的應用前景。但昆蟲病原線蟲常溫儲存貨架期短，是其推廣應用的主要障礙因素之一。線蟲在低溫下處于靜止休眠狀態(tài)，新陳代謝速度減慢，體能消耗減少，其存活率下降速度減慢，從而可延長線蟲貨架期。所以，線蟲低溫儲存已成為當前研究熱點，但適于低溫儲存的線蟲材料和儲存技術尚未解決。

低溫馴化過程能使線蟲產(chǎn)生保護性脫水，然后進行低濕休眠。Grewal[2]認為，低濕休眠利于昆蟲病原線蟲的長期儲存。經(jīng)過低溫馴化后，線蟲的耐寒能力得到增強[3-6]，但耐寒能力的增強程度受不同低溫馴化方式的影響。蕪菁夜蛾斯氏線蟲(Steinernemafeltiae)經(jīng)過直接降溫馴化后，低溫存活率顯著提高；而嗜菌異小桿線蟲(Heterorhabditisbacteriophora)經(jīng)過階段性降溫馴化后，其低溫存活率增加幅度比直接降溫馴化后的增加幅度更大[7]。Grewal[2]研究表明，階段性降溫馴化方式使蘋小卷夜蛾斯氏線蟲(S.carpocapsae)和夜蛾斯氏線蟲(S.riobrave)所獲得的耐寒性較直接馴化更強。楊秀芬等[8]試驗結果證實,低溫誘導有助于培育夜蛾斯氏線蟲A54適應0 ℃以上的低溫特性，但返回25 ℃培養(yǎng)2個侵染循環(huán)后這種特性有不同程度的丟失。

很多學者通過各種方法均提高了昆蟲病原線蟲暫時的耐寒性，而李春杰等[9]從我國高寒地區(qū)分離、篩選獲得的高致病力線蟲本身具有很好的耐寒性。根據(jù)該線蟲能在黑龍江省越冬的自然現(xiàn)象，其低溫儲存潛力及儲存條件已得到初步探索[10-13]。本研究以2個不同品系線蟲為材料，采用不同預處理方式，研究線蟲冷凍儲存前的預處理方式對冷凍后線蟲存活率的影響，進而改善昆蟲病原線蟲儲存技術，以加快我國寒區(qū)高致病力線蟲的開發(fā)應用速度。

1 材料與方法

1.1 材 料

Heterorhabditisbacteriophora-HBN(HBN)，從黑龍江省哈爾濱市(45°45′N)分離得到的昆蟲病原線蟲，低溫致死中溫度是-12.4 ℃，由加拿大線蟲博物館館長郁慶教授鑒定為嗜菌異小桿線蟲哈爾濱品系。H.bacteriophora-NJ(NJ)，從美國新澤西州(40°13′N)引進，也是市場上常用制劑中的線蟲，低溫致死中溫度為-6.1 ℃，相對HBN視為非耐寒線蟲。兩線蟲均保存于中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所農(nóng)田有害生物控制學科組。

1.2 試驗方法

所用線蟲均采用White-Trap法繁殖[14]，對新繁殖出來的感染期線蟲進行不同溫度和時間的預處理。預處理方式有：A為25 ℃放置0 d (記為25 ℃ 0 d，下同)、B為25 ℃放置3 d (25 ℃ 3 d)、C為25 ℃放置7 d (25 ℃ 7 d)、D為10 ℃放置7 d (10 ℃ 7 d)、E為4 ℃放置7 d (4 ℃ 7 d)、F為25 ℃放置3 d然后10 ℃放置3 d (25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d)、G為25 ℃放置3 d然后10 ℃放置3 d然后再4 ℃放置3 d (25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d)。分別取新繁殖出來的線蟲200 μL (107/mL)置于慢速定量濾紙片(北京天宇祥瑞科技有限公司)上，真空抽濾(此時水分與濾紙質量比為10.7∶8.0)后放于0.3 mL離心管中進行不同預處理，然后再經(jīng)歷-4 ℃的低溫冷凍，5 d后升溫至10 ℃保持24 h，于室溫放置1 h后，再將帶有線蟲的濾紙片置于裝有1 mL水的直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中振蕩1 min，解剖鏡下調查線蟲存活率[15]。每種預處理10個離心管，試驗重復3次。預處理過程中25 ℃采用恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司，DH6000A)控制，10，4和-4 ℃采用置于控溫冰箱(青島海爾股份有限公司，BCD-226ST V)內(nèi)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗中所調查的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理和SPSS 11.5軟件分析，計算所得存活率經(jīng)反正弦平方根轉換，然后采用單因素0.05水平方差分析(One-Way ANOVA)和LSD多重比較檢驗各處理組間的差異顯著性。

2 結果與分析

由圖1可以看出，在25 ℃下分別預處理0，3和7 d，即隨著預處理時間的延長，-4 ℃冷凍5 d后HBN和NJ的存活率下降速度逐漸減慢，并且HBN的下降速度較NJ更慢。25 ℃預處理7 d的HBN和NJ冷凍5 d時的存活率分別為93.0%和53.2%，顯著高于2個品系線蟲預處理0 d和3 d時的存活率(17.7%和35.5%，1.6%和2.2%)。

圖1 不同預處理方式對昆蟲病原線蟲冷凍存活率的影響
-◆-.HBN;-□-.NJ
Fig.1 Effect of different pretreatment methods on freezing survival of EPN

在25，10和4 ℃下均預處理7 d，隨著預處理溫度的降低，NJ冷凍5 d時的存活率逐漸下降，分別為53.2%，39.1%和11.0%，差異顯著，而HBN的存活率分別為93.0%，86.1%和94.1%，差異不顯著。

在25 ℃ 3 d、25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d和25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d的預處理方式下，NJ冷凍5 d時的存活率逐漸增加，分別為2.2%，58.5%和83.0%，而HBN經(jīng)25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d和25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d預處理的存活率分別為95.2%和94.1%，顯著高于25 ℃ 3 d處理(35.4%)。

25 ℃ 0 d即直接冷凍的2個品系線蟲-4 ℃冷凍5 d時的存活率最低，HBN為17.7%，NJ為 1.6%。對于HBN而言，除25 ℃ 0 d和25 ℃ 3 d的預處理外，經(jīng)其他5種方式預處理后-4 ℃冷凍5 d時的存活率差異均不顯著(86.1%～95.2%)；而NJ線蟲只有25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d預處理(83.0%)顯著高于其他所有預處理方式。

綜上所述，預處理方式對2個品系線蟲的冷凍存活率有很大影響，并且所有預處理方式均可提高HBN線蟲于-4 ℃冷凍5 d后的存活率，預處理時間對HBN線蟲冷凍存活的影響比預處理溫度更明顯，只要預處理時間達到足夠長(6～7 d)，其存活率較直接冷凍法(25 ℃ 0 d)顯著提高；而NJ對預處理溫度和預處理時間均很敏感。根據(jù)2個品系線蟲在-4 ℃冷凍5 d時的存活率，HBN選擇25 ℃ 7 d、10 ℃ 7 d、4 ℃ 7 d、25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d和25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d的預處理方式均有助于增強其冷凍存活能力，而對于NJ線蟲選用25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d的預處理方式最適于提高-4 ℃的冷凍存活能力?？梢酝茰y生活在不同緯度的同種線蟲(HBN和NJ)對不同預處理溫度適應能力表現(xiàn)出明顯不同。

3 討 論

3.1 低溫脅迫對不同線蟲品種(系)存活的影響

昆蟲病原線蟲對低溫的抵御能力，在不同種屬間，同一種的不同地理種群間，甚至同一個體的不同發(fā)育階段都存在差異。不同種屬的昆蟲病原線蟲對低溫脅迫表現(xiàn)出不同的耐受能力，這首先取決于其遺傳特性[16]。Brown和Gaugler[7]對異小桿科(Heterorhabditidae)和斯氏科(Steinernematidae)線蟲的冷凍耐受力研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過相同條件的冷凍處理后，嗜菌異小桿線蟲(H.bacteriophora)、S.anomali和蕪菁夜蛾斯氏線蟲(S.feltiae)的存活率分別為55.3%，73.6%和92.8%，差異明顯。本研究中經(jīng)不同預處理后-4 ℃冷凍HBN和NJ 2個品系線蟲5 d時的存活率差異明顯，說明同種不同品系的昆蟲病原線蟲對冷凍的耐受能力明顯不同。這可能與其最初的自然生長環(huán)境有關[17]。Smith等[18]比較了自由生活線蟲南極大衛(wèi)全凹線蟲(Panagrolaimusdavidi)、全齒復活線蟲(Panagrellusredivivus)，植物寄生線蟲鱗球莖線蟲(Ditylenchusdipsaci)和昆蟲病原線蟲蘋小卷夜蛾斯氏線蟲(S.carpocapsae)于-15 ℃的冷凍存活率，發(fā)現(xiàn)生活在南極的自由生活線蟲P.davidi的存活率最高。金永玲等[19]認為，線蟲的地理起源對線蟲的生存溫度需求是非常重要的。本研究中，從黑龍江省哈爾濱市分離的線蟲H.bacteriophora-HBN(HBN)經(jīng)不同預處理后于-4 ℃冷凍5 d的存活率均高于從美國引進的H.bacteriophora-NJ(NJ)線蟲，主要可能是由于2個品系線蟲的自然棲息地不同，使得其生態(tài)適應性不同，也可能是長期進化的結果，導致HBN對低溫脅迫的耐受能力強于NJ。

3.2 低溫馴化對線蟲冷凍存活的影響

Burman等[20]認為，通過長期的某種環(huán)境馴化可能會使線蟲適應不同的溫度范圍。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過低溫馴化后，線蟲的耐寒能力得到增強，但耐寒能力的增強程度受到不同低溫馴化方式的影響[2]。從本研究2個品系線蟲冷凍前的預處理結果可以看出，HBN和NJ的冷凍存活率對不同預處理溫度和時間的反映不同，但適當?shù)牡蜏伛Z化利于這2個品系線蟲的冷凍存活。原因可能是未冷凍前的預處理過程使線蟲體內(nèi)積累了相關抗凍物質，如海藻糖和抗凍蛋白等[21]，以應對即將到來的低溫。

線蟲在低溫馴化過程中，利用其特定的發(fā)育階段來抵御不良的環(huán)境脅迫。Wharton等[21-22]指出，H.zealandica的殼能預防無害的結冰，能允許最大限度的溫度達-32 ℃，該線蟲有過冷卻現(xiàn)象，即在冰點以下保持體液流動的能力。昆蟲病原線蟲的侵染期線蟲是3齡幼蟲包在2齡幼蟲脫下的體鞘內(nèi)，其體鞘起著重要的保護作用。關于線蟲HBN和NJ對低溫馴化過程中的生理生化反應及分子水平研究，還有待于下一步的深入挖掘。

志謝：感謝美國Rutgers大學王義老師在試驗過程中的幫助！

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Effect of pretreatment method on freezing survival of entomopathogenic nematodes

LI Chun-jie,WANG Li-fang,PAN Feng-juan,XU Yan-li

(KeyLaboratoryofMollisolsAgroecology,NortheastInstituteofGeographyandAgroecology,ChineseAcademyofSciences,Harbin,Heilongjiang150081,China)

【Objective】 In order to improve storage technology of entomopathogenic nematodes (EPNs),the methods to increase freezing survival of EPNs were explored.【Method】 Two strong virulence strains of EPNs,Heterorhabditisbacteriophora-HBN (HBN) with cold tolerance isolated from Harbin (China,45°45′N) andH.bacteriophora-NJ (NJ) from New Jersey (USA,40°13′N),were used in this study.The survival rates of HBN and NJ at -4 ℃ for 5 days after different pretreatment methods were compared.【Result】 The freezing survival rates of HBN pretreated at 25 ℃ for 7 d,10 ℃ for 7 d,4 ℃ for 7 d,25 ℃ for 3 d then 10 ℃ for 3 d,and 25 ℃ for 3 d and 10 ℃ for 3 d before 4 ℃ for 3 d were 86.1% to 95.2%,which were significantly higher than that of 25 ℃ for 0 d (17.7%).The highest freezing survival rate of 83.0%,was obtained for NJ when pretreated at 25 ℃ for 3 d and 10 ℃ for 3 d before 4 ℃ for 3 d,which was significantly higher than those of other pretreatment methods (2.2% to 58.5%).【Conclusion】 Freezing survival rates of HBN and NJ could be increased by appropriate pretreamtents.But the best pretreatment methods for the same species (HBN and NJ) isolated from different geographical latitudes were different.

entomopathogenic nematode;preprocessing;cold acclimation;freezing storage;survival rate

2013-09-29

國家科技計劃農(nóng)業(yè)成果轉化項目(2007GB24910482)；國家自然科學基金項目(31000205)；黑龍江省青年科學基金項目(QC2010070)；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才項目(2009RFQYN092)

李春杰(1976-)，女，黑龍江依安人，副研究員，博士，主要從事作物病蟲害生物生態(tài)控制及機理研究。 E-mail:lichunjie@neigaehrb.ac.cn

許艷麗(1958-)，女，遼寧本溪人，研究員，博士，主要從事農(nóng)田有害生物控制研究。

時間:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.026

S432.4+5

A

1671-9387(2015)02-0198-05

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.026.html