趙 倩，楊 亮，王紅麗，王 斌，吳 濤，迪力夏提·金斯汗，吐魯洪·沙吾列，朱麗萍

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新疆地區(qū)不同民族早發(fā)性和三陰性乳腺癌易患基因1突變研究

趙 倩，楊 亮，王紅麗，王 斌，吳 濤，迪力夏提·金斯汗，吐魯洪·沙吾列，朱麗萍

目的 研究新疆地區(qū)漢族和維吾爾族早發(fā)性、三陰性乳腺癌易患基因1(BRCA1)基因的突變情況及臨床病理特征。方法 選取2012年7月—2014年8月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的早發(fā)性(發(fā)病年齡≤35歲)、三陰性乳腺癌患者60例，其中漢族30例，維吾爾族30例，運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和DNA測序檢測BRCA1基因突變，并結(jié)合臨床病理因素進(jìn)行分析。結(jié)果 60例早發(fā)性、三陰性乳腺癌患者BRCA1突變率為18.3%(11/60)，其中維吾爾族患者BRCA1突變率為30.0%(9/30)，漢族患者BRCA1突變率為6.7%(2/30)，兩者突變率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.454，P=0.019)。60例患者BRCA1突變的位點(diǎn)共11個(gè)，其中8個(gè)可引起氨基酸錯(cuò)義突變，2個(gè)移碼突變，1個(gè)拼接點(diǎn)突變。BRCA1基因突變者與無突變者民族、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)、Ki-67表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 新疆地區(qū)維吾爾族和漢族早發(fā)性、三陰性乳腺癌BRCA1基因突變存在差異，BRCA1突變者臨床表現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多、Ki-67蛋白高表達(dá)，提示早發(fā)性、三陰性乳腺癌可能發(fā)病早，惡性程度高。

乳腺腫瘤；早發(fā)性；三陰性；基因，BRCA1；DNA測序

趙倩，楊亮，王紅麗，等.新疆地區(qū)不同民族早發(fā)性和三陰性乳腺癌易患基因1突變研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(14)：1650-1654.[www.chinagp.net]

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目前，乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[1]。攜帶某些乳腺癌的易患基因可能與乳腺癌的發(fā)病關(guān)系密切。乳腺癌易患基因1、2(breast cancer susceptibility gene one，BRCA1/2)突變率在家族性乳腺癌患者中較高，BRCA1在不同種族或不同地區(qū)間突變情況存在一定的差異[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，歐美家族性乳腺癌的BRCA1突變率高達(dá)45%[4]。在新疆地區(qū)因不同民族的遺傳背景、生活方式等不同，乳腺癌的發(fā)生率存在差異，新疆地區(qū)不同民族早發(fā)性、三陰性乳腺癌BRCA基因突變情況仍不明確。早發(fā)性乳腺癌是指發(fā)病年齡≤35歲，三陰性乳腺癌是指免疫組織化學(xué)檢測分型為雌激素受體(ER)陰性，孕激素受體(PR)陰性，人類表皮生長因子受體(cerbB-2)陰性的一類乳腺癌。早發(fā)性、三陰性乳腺癌是臨床惡性程度較高，預(yù)后較差的類型，其臨床特征是否和BRCA1基因突變有關(guān)需要進(jìn)一步研究，故本研究選擇新疆地區(qū)不同民族早發(fā)性、三陰性乳腺癌患者的BRCA1基因突變情況進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年7月—2014年8月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的早發(fā)性、三陰性乳腺癌患者60例，均為女性，年齡22～35歲，中位年齡34歲；維吾爾族30例，漢族30例。入選患者均為首次診斷為原發(fā)性乳腺癌，既往無其他腫瘤史、家族史，無化療、放療史；排除妊娠及哺乳期乳腺癌患者。入選患者均接受手術(shù)或粗針穿刺治療診斷明確，均簽署留取標(biāo)本的知情同意書，自愿接受檢查。本研究獲得新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 使用天根提取試劑盒(型號(hào)DP319-02)提取血液標(biāo)本中基因組DNA(非離心柱型)，使用核酸蛋白定量儀器檢測提取的DNA濃度，提取的DNA經(jīng)過質(zhì)檢并合格后放置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)數(shù)據(jù)庫Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)及文獻(xiàn)選取BRCA1基因突變率較高的第10、2、18、5、20號(hào)外顯子進(jìn)行研究。由上海生物公司合成PCR引物，引物序列和條件見表1。PCR檢測試劑盒由Bio-Rad，USA公司提供，PCR反應(yīng)液為30 μl，內(nèi)含合格的DNA提取樣本50 ng，95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，退火溫度30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，循環(huán)40次，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存，放置5 μl PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳中使用120 V恒壓電泳30 min，使用成像儀觀察、記錄并保存結(jié)果。

1.2.3 基因序列測定及分析 將凝膠電泳出現(xiàn)條帶異常的標(biāo)本對BRCA1外顯子10、18、2、5和20區(qū)域進(jìn)行PCR直接測序分析，將直接測序分析得到的BRCA1基因的突變位點(diǎn)在信息中心網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(Breast Cancer Information Core，BIC)中作對照，判定是否存在突變。

表1 PCR反應(yīng)條件及擴(kuò)增產(chǎn)物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的分析采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增電泳圖 經(jīng)過質(zhì)檢合格的BRCA1全基因組PCR擴(kuò)增標(biāo)本在1%瓊脂糖凝膠電泳中顯示單一條帶(見圖1)，BRCA1基因組2、10號(hào)外顯子基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖2。

圖1 BRCA1基因組擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure 1 Electrophoretogram of amplification products in BRCA1 genome

圖2 BRCA1基因組2、10號(hào)外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure 2 Electrophoretogram of amplification products of No.2 and No.10 exon in BRCA1 genome

2.2 BRCA1基因突變檢測結(jié)果 通過設(shè)計(jì)引物，對電泳提示有突變的可能性標(biāo)本進(jìn)行BRCA1 2、5、10、18和20號(hào)外顯子PCR直接測序分析，共發(fā)現(xiàn)11個(gè)突變位點(diǎn)(見表2)，部分BRCA1基因序列測定結(jié)果見圖3。60例早發(fā)性、三陰性乳腺癌BRCA1突變率為18.3%(11/60)，其中維吾爾族BRCA1突變率為30.0%(9/30)，漢族BRCA1突變率為6.7%(2/30)，兩者突變率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.454，P=0.019)。

2.3 BRCA1基因是否突變者臨床病理特征比較 BRCA1基因突變者與無突變者民族、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)、Ki-67表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組腫塊大小、P53表達(dá)情況、病理類型、病理組織學(xué)分級(jí)、TNM分期比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

注：a=Exon2 rs43124072 GA，b=Exon2 rs43124072 GG；c=Exon10 rs43094720 AG，d=Exon10 rs43094720 GG；e=Exon18 rs3092994 AG，f=Exon18 rs3092994 GG

圖3 部分BRCA1基因序列測定結(jié)果

注：Exon=外顯子，F(xiàn)S=移碼突變，MS=錯(cuò)義突變，SP=拼接點(diǎn)突變，NO=無義突變，A=腺嘌呤，G=鳥嘌呤，T=胸腺嘧啶，C=胞嘧啶，G>A=在基因位置堿基移碼突變由G變?yōu)锳，BIC=信息中心網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫

表3 BRCA1基因是否突變者臨床病理特征比較〔n(%)〕

Table 3 Comparison of clinical pathological features between patients with and without BRCA1 gene mutation

臨床病理特征BRCA1突變(n=11)BRCA1無突變(n=49)χ2值P值民族5.460.04 漢族2(18.2)28(57.1) 維吾爾族9(81.8)21(42.9)腫塊大小(cm)2.330.36 <28(72.7)23(46.9) 2～52(18.2)20(40.8) >51(9.1)6(12.3)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6.540.03 無轉(zhuǎn)移3(27.3)29(59.2) 1～3個(gè)6(54.5)8(16.3) ≥4個(gè)2(18.2)12(24.5)P53表達(dá)3.680.09 陽性8(72.7)20(40.8) 陰性3(27.3)29(59.2)Ki-67(%)4.900.04 >159(81.8)22(44.9) ≤142(18.2)27(55.1)病理類型1.330.83 非浸潤性癌2(18.2)4(8.2) 早期浸潤性癌2(18.2)10(20.4) 浸潤性非特殊癌6(54.5)29(59.2) 浸潤性特殊癌1(9.1)6(12.2)病理組織學(xué)分級(jí)(級(jí))1.400.47 Ⅰ1(9.1)3(6.1) Ⅱ2(18.2)17(34.7) Ⅲ8(72.7)29(59.2)TNM分期(期)2.460.50 Ⅰ1(9.1)4(8.2) Ⅱ2(18.2)20(40.8) Ⅲ6(54.5)19(38.8) Ⅳ2(18.2)6(12.2)

3 討論

乳腺癌是婦女常見的惡性腫瘤之一，目前發(fā)病率逐年增高。一般認(rèn)為，乳腺癌的發(fā)病可能與易患基因有密切關(guān)系，但發(fā)病機(jī)制仍不清楚。乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展可能是多基因參與、多步驟、多因素相互作用的復(fù)雜過程，BRCA基因家族是近年來發(fā)現(xiàn)和乳腺癌發(fā)病密切的基因之一[5]，其突變與大多數(shù)家族遺傳性乳腺癌及部分人群散發(fā)性乳腺癌的發(fā)生有密切的關(guān)系[6]。在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞生物周期調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用，該基因能夠抑制腫瘤細(xì)胞、維護(hù)基因組穩(wěn)定性[7]。有研究表明，BRCA1基因突變與家族性、早發(fā)性乳腺癌的發(fā)病密切相關(guān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1基因突變的頻率和位點(diǎn)也具有明顯的種族和地域性差異[8-10]。

本研究針對新疆地區(qū)三陰性、早發(fā)性乳腺癌患者BRCA1突變進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，新疆地區(qū)漢族和維吾爾族婦女早發(fā)性、三陰性乳腺癌組織中BRCA1的突變表達(dá)率分別為6.7%和30.0%，略高于部分學(xué)者文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于早發(fā)性、三陰性乳腺癌BRCA1的突變比例(5.00%和12.86%)[11]。既往研究提示，不同地區(qū)、不同種族之間BRCA1基因突變存在一定的差異，BRCA1基因突變的基因型可能和乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。前期的研究結(jié)果也顯示，新疆地區(qū)漢、維吾爾族婦女早發(fā)性乳腺癌組織中BRCA1突變存在顯著差異[12]?？赡苡幸韵略颍?1)新疆少數(shù)民族地區(qū)維吾爾族屬于白種人群，在遺傳背景上與其他民族不同；(2)維吾爾族與漢族存在文化背景、生活風(fēng)俗、地理環(huán)境及飲食文化等諸多差異。有研究發(fā)現(xiàn)，新疆地區(qū)維吾爾族乳腺癌病理特征表現(xiàn)為腫塊較大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目多、年輕三陰性乳腺癌患者比例較高，激素受體陽性表達(dá)率較低等特點(diǎn)[13-15]，針對乳腺癌患者BRCA1突變檢測，可能為預(yù)后的判斷提供依據(jù)。研究表明，BRCA1與新疆地區(qū)維吾爾族婦女三陰性、早發(fā)性乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示，在新疆地區(qū)維吾爾族女性散發(fā)性乳腺癌患者中，BRCA1的突變患者中Ki-67表達(dá)及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯增加，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，BRCA1基因突變提示腫瘤預(yù)后較差和惡性程度較高。

乳腺癌的發(fā)病和多因素有關(guān)，新疆地區(qū)是多民族聚居地區(qū)，維吾爾族為主要的少數(shù)民族之一，不同的民族在生活習(xí)慣、遺傳背景等方面可能有差別，本研究入組病例為無乳腺癌家族史的維吾爾族和漢族三陰性、早發(fā)性乳腺癌患者，對不同類型乳腺癌BRCA1基因突變情況進(jìn)行檢測，得到了一些初步的資料，但由于各方面原因入組病例數(shù)偏少可能會(huì)影響分析結(jié)果。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究，針對不同特點(diǎn)的乳腺癌進(jìn)行分析，采用根據(jù)循證醫(yī)學(xué)下的個(gè)體化治療是目前研究及以后的工作目標(biāo)。

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(本文編輯：賈萌萌)

Mutation of Breast Cancer Susceptibility Gene 1 in Women With Early-onset and Triple-negative Breast Cancer in Different Nationalities in Xinjiang Area

ZHAOQian，YANGLiang，WANGHong-li，etal.

TheFirstWard，DepartmentofGalactophoreSurgery，TumorHospitalAffiliatedtoXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830000，China

Objective To study the mutation of breast cancer susceptibility gene 1(BRCA1)in Han and Uygur women with early-onset and triple-negative breast cancer in Xinjiang Area and the clinic pathologic features.Methods A total of 60 patients with early-onset(≤35 years old)and triple-negative breast cancer who were admitted into the Tumor Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University from July 2012 to August 2014 were enrolled，including 30 Han people and 30 Uygur people.Tests of polymerase chain reaction(PCR)and DNA sequencing were conducted to detect BRCA1 gene mutation，and the test results were analyzed in combination with clinic pathologic characteristics.Results The BRCA1 gene mutation rate was 18.3%(11/60) for all subjects，30.0%(9/30)for Uygur subjects and 6.7%(2/30)for Han subjects，with significant difference between the two groups(χ2=5.454，P=0.019).The total number of mutant sites was 11，including eight amino acid missense mutations，two frame-shift mutations and one splice mutation.Subjects with BRCA1 gene mutation and subjects without mutation were significantly different in ethnic group，number of lymphatic metastasis and Ki-67 expression(P<0.05).Conclusion Uygur and Han women with early-onset and triple-negative breast cancer in Xinjiang Area are different in BRCA1 gene mutation.The manifestations of BRCA1 gene mutation include more lymphatic metastasis and higher level of Ki-67 expression，suggesting that early-onset and triple-negative breast cancer may happen earlier with higher malignancy.

Breast neoplasms；Early-onset；Triple-negative；Genes，BRCA1；DNA sequencing analysis

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012211A031)；2014年腫瘤醫(yī)院啟動(dòng)基金(腫2014-11)

830000新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科一病區(qū)

朱麗萍，830000新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科一病區(qū)；E-mail：vlp-1005@sina.com

R 737.9

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.14.012

2014-11-14；

2015-02-07)