趙陽(延安大學(xué)咸陽醫(yī)院，陜西咸陽712099)

氧化苦參堿對H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

趙陽
(延安大學(xué)咸陽醫(yī)院，陜西咸陽712099)

摘要:目的研究氧化苦參堿對于由H2O2所致的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法建立H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，取對數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分成4組:①正常對照組，不加任何處理因素;②模型組:在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為200 μmol/L H2O2培養(yǎng)6 h;③苦參堿低、高劑量組:在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入低、高濃度(20、60 μmol/L)的苦參堿培養(yǎng)12 h，再加入終濃度為200 μmol/L的氧化應(yīng)激繼續(xù)培養(yǎng)6 h。采用MTT法檢測細(xì)胞存活率，收集細(xì)胞上清及培養(yǎng)基，采用ELISA法檢測丙二醛(MDA)水平及乳酸脫氫酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率，Western blotting法檢測p-AKT、AKT、p-Bad、Bad、Bcl-2、Bax蛋白。結(jié)果與正常對照組比較，模型組細(xì)胞存活率降低、調(diào)亡率升高，細(xì)胞上清液中LDH活性增強(qiáng)、SOD活性減弱、MDA水平升高，p-AKT、Bcl-2、p-Bad蛋白水平降低，Bax升高(P均＜0.05)。與模型組比較，苦參堿低、高劑量組細(xì)胞存活率提高，凋亡率降低，細(xì)胞上清液中MDA水平降低以及LDH活性減弱，SOD活性增強(qiáng)，p-AKT、Bcl-2、p-Bad蛋白表達(dá)量升高，Bax的表達(dá)降低(P均＜0.05)。結(jié)論苦參堿可以通過影響p-AKT及其下游蛋白Bad表達(dá)，對H9c2心肌細(xì)胞由H2O2引起的氧化應(yīng)激損傷起保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞:氧化應(yīng)激損傷;過氧化氫;氧化苦參堿;凋亡; Bad

氧化應(yīng)激是造成心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能異常的重要原因，與心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等具有密切聯(lián)系。H2O2是一種活性氧，具有高反應(yīng)性，可以促進(jìn)氧自由基的生成，并可呈濃度和時(shí)間依賴性誘導(dǎo)心肌凋亡。因此常被用于心血管系統(tǒng)氧化應(yīng)激的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。氧化苦參堿(苦參素)是從中藥苦參、苦豆子、廣豆根等植物中提取的生物堿。氧化苦參堿藥理作用廣泛，具有抗病毒、強(qiáng)心、降壓、抗炎、殺菌、抗腫瘤以及鎮(zhèn)靜催眠、解熱鎮(zhèn)痛、抗過敏等作用［1～5］。研究表明，氧化苦參堿對大鼠急性缺血損傷的心肌具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制脂質(zhì)過氧化和增加內(nèi)生性抗氧化劑活性，保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能從而減少細(xì)胞凋亡有關(guān)［6］。2014年3～7月，本研究旨在從細(xì)胞水平探討氧化苦參堿對于心肌細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用以及其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料H9c2心肌細(xì)胞(來自本實(shí)驗(yàn)室):接種于含10%胎牛血清(美國HyClone公司)的高糖DMEM(美國Gibico公司)培養(yǎng)基中，細(xì)胞孵箱(美國Thermo公司)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶進(jìn)行消化，以1∶4比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。試劑及儀器:酶標(biāo)儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Biord公司);mTT溶液、化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海，碧云天);流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，BD公司);丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化歧化酶(SOD)檢測試劑盒(南京建成)。

1.2氧化應(yīng)激損傷模型的建立及分組將H9c2細(xì)胞按照5×105/mL分別接種于96孔板和6孔板。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)細(xì)胞均更換新鮮無血清培養(yǎng)液。按隨機(jī)原則分為5組:①對照組，不加任何處理因素;②模型組:在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為200 μmol/L H2O2培養(yǎng)6 h;③苦參堿低、高劑量組:在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入低、高濃度(20、60 μmol/L)的苦參堿培養(yǎng)12 h，再加入終濃度為200 μmol/L的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.3心肌細(xì)胞存活率的檢測采用MTT法。將H9c2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/mL，按200 μL/孔接種于96孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)6 h貼壁后，按照上述各實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，然后每孔中加入20 μLmTT溶液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培育4 h，加入150 μLdMSO溶液，在490 nm波長測定吸光度(A)值，設(shè)置不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照組，比色時(shí)作為空白調(diào)零孔，每組重復(fù)8

孔。細(xì)胞存活率(%)=處理組A值/空白對照組A 值×100%。

1.4心肌細(xì)胞中SOD、LDH活性及MDA水平的檢測采用ELISA法。將H9c2細(xì)胞按5×105/mL接種6孔板，按上述實(shí)驗(yàn)分組處理后，取其上清液測定LDH活性。將6孔板中的心肌細(xì)胞用胰酶消化后收集，置于－70℃、20min后37℃水浴10min，反復(fù)凍融10次，待懸液由渾濁漸變透明后，收集培養(yǎng)基測定SOD活性和MDA水平，實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5心肌細(xì)胞凋亡率的檢測采用流式細(xì)胞術(shù)。將H9c2細(xì)胞按5×105/mL接種6孔板按照上述實(shí)驗(yàn)分組處理，用0.25%胰酶進(jìn)行消化，PBS洗滌3次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，分別重懸于200 μL結(jié)合緩沖液，加入10 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI室溫避光孵育15min，再加入300 μL結(jié)合緩沖液，300目篩網(wǎng)過濾后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6蛋白激酶B(AKT)相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測采用Western blotting法。上述各實(shí)驗(yàn)組處理過的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，收集細(xì)胞加入裂解緩沖液4℃裂解25min，收集細(xì)胞裂解液，離心后收集上清液。BRADFORD法測定裂解液中總蛋白含量。取細(xì)胞裂解液上樣于SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠，每孔45 μg蛋白電泳。電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。加入封閉液封閉1h，再加入抗靶蛋白抗體溶液4℃孵育過夜，洗膜，加入二抗工作液室溫孵育1 h，洗膜，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測靶蛋白的表達(dá)。結(jié)果用Image J軟件分析，計(jì)算條帶的吸光度值。采用目的蛋白與內(nèi)參的比值來表示蛋白表達(dá)水平。

2　結(jié)果

2.1各組心肌細(xì)胞生存率，SOD、LDH活性及MDA水平比較見表1。

表1　各組心肌細(xì)胞生存率，SOD、LDH活性及MDA水平比較()

表1　各組心肌細(xì)胞生存率，SOD、LDH活性及MDA水平比較()

注:與對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05。

組別　　生存率(%)　LDH(U/L)　MDA(nmol/L)　SOD(U/mL)對照組100　14.83±1.93　3.12±0.32　51.83±4.23模型組　42.72±2.87*　31.43±3.92*　5.62±0.48*　27.98±3.14*苦參堿低劑量組　54.89±3.26#　19.43±1.98#　5.08±2.82#　35.28±3.04#苦參堿高劑量組　68.32±4.83#　24.83±3.87#　4.28±2.82#　41.92±2.86#

2.2各組心肌細(xì)胞凋亡率比較對照組、模型組、苦參堿低劑量組、苦參堿高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率分別為(2.54±0.26)%、(41.54±4.21)%、(25.15 ±2.15)%、(15.42±2.56)%。模型組高于對照組，苦參堿低、高劑量組均高于模型組(P均＜0.05)。

2.3各組心肌細(xì)胞中AKT、p-AKT、Bcl-2、Bad、p-Bad、Bax水平比較見表3。

表3　各組心肌細(xì)胞中AKT、p-AKT、Bcl-2、Bad、p-Bad、Bax水平比較()

表3　各組心肌細(xì)胞中AKT、p-AKT、Bcl-2、Bad、p-Bad、Bax水平比較()

注:與對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05。

組別AKT　p-AKT　Bcl-2　Bad　p-Bad　Bax對照組　0.93±0.06　0.82±0.07　0.98±0.07　0.82±0.05　0.64±0.06　0.28±0.02模型組　0.90±0.07　0.18±0.02*　0.17±0.01*　0.81±0.06　0.13±0.03*　0.85±0.05*苦參堿低劑量組　0.91±0.06　0.25±0.01﹟　0.28±0.02　0.83±0.07　0.26±0.02﹟　0.43±0.04﹟苦參堿高劑量組　0.90±0.04　0.48±0.03﹟　0.42±0.03　0.82±0.05　0.38±0.01﹟　0.27±0.04﹟

3　討論

氧化應(yīng)激損傷是機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)活性氧過多產(chǎn)生或代謝障礙，超過內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)對其消除能力時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化并引發(fā)溶酶體、線粒體損傷的現(xiàn)象［7］。

H2O2是一種重要的ROS來源，是體內(nèi)氧化代謝的產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的氧化能力，可以自由穿過細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的鐵離子反應(yīng)生成活性更強(qiáng)的自由基，引起細(xì)胞膜損傷。除此之外，它還能通過脂質(zhì)過氧化物分解代謝產(chǎn)物MDA，促使蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合，并通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8，9］。

本實(shí)驗(yàn)中H2O2處理細(xì)胞后，心肌細(xì)胞存活率顯著降低，培養(yǎng)基中LDH活性顯著升高，表明H2O2有顯著的心肌細(xì)胞毒性作用，模型建立成功。心肌細(xì)胞內(nèi)MDA水平明顯增高，而SOD活性下降，表明心肌細(xì)胞抗氧化自由基損傷的能力下降，細(xì)胞發(fā)生了氧化應(yīng)激損傷。用不同濃度氧化苦參堿處理后，心肌細(xì)胞存活率較模型組明顯提高，培養(yǎng)基中LDH活性和MDA水平較模型組明顯降低，SOD活性明顯升高，說明氧化苦參堿具有抗氧化應(yīng)激損傷的作用。

在心肌細(xì)胞凋亡的研究中，線粒體凋亡通路是主要途徑，缺血再灌注損傷會導(dǎo)致線粒體凋亡途徑的激活，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，并伴隨著caspase-9的激活而引起細(xì)胞凋亡［10］。

AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶。研究表明，AKT處于許多線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路的交匯點(diǎn)，直接或間接地調(diào)控細(xì)胞凋亡。Bad是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，能與Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合形成復(fù)合

體。AKT能磷酸化Bad，使Bad從復(fù)合物分離，這樣一方面抑制了Bad的促凋亡作用，另一方面有利于解離的Bcl-2和Bcl-XL發(fā)揮抗凋亡作用。因此，AKT可以通過p-Bad抑制細(xì)胞凋亡。

除此之外，Bad結(jié)合Bcl-2，可以使Bcl-2不能結(jié)合并抑制促凋亡基因Bax，Bax結(jié)合到線粒體膜上，改變線粒體內(nèi)外膜之間的離子濃度，從而打開線粒體外膜，然后細(xì)胞色素C從線粒體中流到細(xì)胞質(zhì)中，與凋亡蛋白水解酶激活因子Apaf-1及caspase-9共同組成凋亡體，接著激活caspase-3，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)模型組p-AKT、Bad、Bcl-2蛋白的表達(dá)較對照組明顯降低，而Bax蛋白表達(dá)顯著上升。與模型組比較，苦參堿低、高劑量組p-AKT、Bad、Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)降低。提示氧化苦參堿可以通過p-AKT進(jìn)而磷酸化下游Bad蛋白，使Bad-Bcl-2-BCL-XL復(fù)合物解離，抑制Bax的作用，從而達(dá)到抗凋亡的目的，對心肌細(xì)胞具有抗氧化應(yīng)激損傷作用。

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收稿日期:( 2015-06-16)

文章編號:1002-266X(2015)37-0029-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R542.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.37.009