周琳

（太原師范學(xué)院化學(xué)系 山西太原 030031）

色氨酸化學(xué)名稱為氨基吲哚基丙酸，是人體八種必需氨基酸之一。它在動(dòng)物體內(nèi)不能自行合成，而且動(dòng)物體內(nèi)各組織中含量都較低。色氨酸有許多生理生化功能，主要是促進(jìn)肝微粒體部分能，它還以結(jié)合態(tài)存在于組織細(xì)胞中，起控制神經(jīng)系統(tǒng)的作用。色氨酸系氨基酸類藥物，對(duì)抑郁癥、失眠癥、高血壓及止痛等有良好療效，臨床應(yīng)用廣泛[1]。目前，定量測(cè)定色氨酸的方法主要有：吸光光度法、熒光光譜法、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法、荷移分光光度法、高效液相色譜法等[2-4]。用熒光猝滅法研究色氨酸與2,6-二氯醌氯亞胺(DBQ）的荷移反應(yīng)未見(jiàn)報(bào)道，本文研究了色氨酸與DBQ 在三酸緩沖介質(zhì)中發(fā)生荷移反應(yīng)，形成荷移絡(luò)合物的最佳條件，旨在建立一種測(cè)定色氨酸含量的荷移熒光分光光度新方法。

一、實(shí)驗(yàn)研究

1.實(shí)驗(yàn)主要儀器及試劑

儀器 WGY-10 型熒光分光光度計(jì)；PE 公司LS55 熒光分光光度計(jì)；HH-6 電熱恒溫水浴鍋；92M-202A-DR 電子天平；211-酸度計(jì)(意大利Hanna)；XYJ-802 離心沉淀機(jī)等。

試劑 L-色氨酸；DBQ；磷酸(AR)；冰醋酸(AR)；硼酸(AR)等。

2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程

（1）溶液的配制

L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱量L-色氨酸0.10220g，用水溶解，轉(zhuǎn)入100mL 容量瓶中，然后用水定容至刻度，配成1.0220g/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，放于冰箱中避光保存，操作液由貯備液稀釋配制。用時(shí)配成1.0220×10-2g/L 的水溶液。

DBQ 乙醇溶液：準(zhǔn)確稱取0.24979g 2,6-二氯醌氯亞胺，用無(wú)水乙醇溶解，轉(zhuǎn)移到250mL 棕色的容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容到刻度，配成1g/L 的溶液。用時(shí)配成0.1g/L 的乙醇溶液。

pH=11.0的三酸緩沖溶液：分別取2.70 mL磷酸、2.29mL冰醋酸、2.47g 硼酸于1000 mL 容量瓶中并用水稀釋至刻度，在酸度計(jì)下，用0.2mol/L 的氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH=11.0。

（2）實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確移取適量色氨酸溶液于10mL 比色管中，用pH=11.0 的三酸緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，在室溫下反應(yīng)15min 后，用1cm 石英熒光池，以280nm 為激發(fā)波長(zhǎng)，在波長(zhǎng)為360nm 處測(cè)量溶液發(fā)射強(qiáng)度F1。

準(zhǔn)確移取適量色氨酸溶液于10mL 比色管中，加1.0 mL DBQ乙醇溶液，用pH=11.0的三酸緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，在室溫下反應(yīng)15min 后，加入1cm 石英熒光池中，以280nm 為激發(fā)波長(zhǎng)，在波長(zhǎng)為360 nm 處測(cè)量溶液發(fā)射強(qiáng)度F2。計(jì)算熒光猝滅量△F = F1-F2。

二、結(jié)果與討論

1.條件的選擇

（1）用熒光分光光度計(jì)對(duì)水、DBQ 的乙醇溶液、色氨酸溶液、色氨酸-DBQ 溶液進(jìn)行激發(fā)和發(fā)射光譜掃描，結(jié)果表明，水、DBQ 對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，實(shí)驗(yàn)分別選擇色氨酸溶液的激發(fā)峰和發(fā)射峰280 nm 和360 nm 作為激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)；

圖2 發(fā)射光譜圖

圖1 激發(fā)光譜圖

（2）選用不同的溶劑配制溶液，測(cè)定相應(yīng)色氨酸、色氨酸-DBQ 體系的熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，甲醇中熒光猝滅程度比水介質(zhì)中的熒光猝滅程度稍大，但水價(jià)廉無(wú)污染，故選用水為溶劑。

（3）選用不同溫度下不同反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示在室溫 (19.8℃) 下反應(yīng)15min 后，熒光猝滅量變化很小，反應(yīng)達(dá)到平衡，在90 min 內(nèi)色氨酸的熒光強(qiáng)度變化不多。在30℃和40℃時(shí)反應(yīng)雖很快達(dá)到平衡，但色氨酸的熒光強(qiáng)度逐漸減小，故選反應(yīng)溫度為19.8℃，反應(yīng)時(shí)間為15min。

（4）改變?cè)噭〥BQ 乙醇溶液的用量進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DBQ 乙醇溶液為1.0 mL 時(shí)，熒光猝滅程度最大，故選擇其用量為1.0mL。

（5）用pH 為0.00-14.00 的三酸緩沖溶液稀釋到刻度進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，色氨酸的熒光強(qiáng)度受溶液的酸堿度的影響非常顯著，隨著pH的增加，色氨酸的熒光強(qiáng)度呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，色氨酸在堿性介質(zhì)中自體熒光很強(qiáng)。pH=11.00 時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，DBQ 對(duì)色氨酸的熒光猝滅效應(yīng)也最大，故選用pH=11.00 的三酸緩沖溶液。

（6）準(zhǔn)確加入1 mL 0.1mol/L 不同種類的表面活性劑進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，不加表面活性劑的反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的猝滅量最大，因此該實(shí)驗(yàn)不選用表面活性劑。

（7）按照不同順序加樣進(jìn)行測(cè)定，表明DBQ +色氨酸+ pH=11.0 的三酸緩沖溶液的順序效果最佳。

2.精密度的測(cè)定

在選定的最佳條件下，對(duì)含有0.51μg/mL 的色氨酸溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法平行測(cè)定15 次，結(jié)果表明，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.256，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%。

3.工作曲線的繪制

準(zhǔn)確移取不同量的色氨酸溶液，在選定的最佳條件下反應(yīng)后進(jìn)行測(cè)定，并繪制工作曲線，結(jié)果顯示，色氨酸的含量在0.51 ～1.33μg/mL 時(shí)熒光強(qiáng)度差值與色氨酸的含量呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為△F =0.9251+37.647c（單位為μg/mL），相關(guān)系數(shù)R=0.9990。進(jìn)行計(jì)算，得到方法的檢測(cè)限為0.02μg/mL，即在信噪比為3 時(shí)，其檢測(cè)限為0.02μg/mL。

4.共存物質(zhì)的影響

在選定的最佳條件下，對(duì)于測(cè)定10mL 溶液中10μg的色氨酸，在反應(yīng)體系中加入1.0mL 濃度均為0.5g/L 的8種不同的干擾試劑進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，在10μg 的色氨酸存在下，加入量均為500μg 的KCl，NaCl，葡萄糖，蔗糖，熒光測(cè)定值誤差小于±5%，其中葡萄糖的干擾程度最??；而加入量均為500μg 的苯丙氨酸，酪氨酸，Ni(NO3)2· 6H2O， Ca(NO3)2· 4H2O，熒光測(cè)定值誤差大于±5%，其中酪氨酸的干擾程度最大。

三、樣品測(cè)定及回收率實(shí)驗(yàn)

1.樣品的測(cè)定

（1）取血清1.0mL 于10mL 的離心試管中，加入3.0mL的乙醇除蛋白，靜置5min，放入XYJ-802 離心沉淀機(jī)中，4000r/min,離心10min。

（2）取上清液0.2mL 于10ml 的比色管中，用pH 為11.00 的三酸緩沖溶液稀釋到刻度，搖勻；

（3）取上清液0.2mL 于10mL 的比色管中，加入1.0mL DBQ乙醇溶液，用pH為11.00的三酸緩沖溶液稀釋到刻度，搖勻，充分混合作用15 min。

測(cè)得血清，血清-DBQ 體系的熒光強(qiáng)度均為0。

2.回收率實(shí)驗(yàn)

按照樣品測(cè)定方法在0.2mL 血清中分別加入不同量的0.01g/mL 的色氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定，血清的回收率為97.5 ～100.6%。

[1]李劍欣，張緒梅，徐琪壽．色氨酸的生理生化作用及其應(yīng)用[J]．氨基酸和生物資源，2005，27(3)：58 62．

[2]范哲鋒，杜黎明，靳曉濤．色氨酸熒光猝滅法測(cè)定人發(fā)稀土總量[J]．分析化學(xué), 2001，29(9)：1049 1051．

[3]魏永鋒，馬冬梅，趙瓊．比值導(dǎo)數(shù)熒光光譜法同時(shí)測(cè)定色氨酸和5-羥基色氨酸[J]．分析實(shí)驗(yàn)室．2006，25(9)：75-77．

[4]夏國(guó)華，戚雪勇，傅海珍等．荷移熒光光譜法測(cè)定楊樹(shù)桑黃子實(shí)體的總黃酮[J]．光譜實(shí)驗(yàn)室．2012，29(4)：2425-2428．