陳慧慧 傅紅興 曹雄杰 何文萃 戴丹萍 邱凱燕 張偉

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 浙江溫州 325035；2.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科 浙江寧波 315000）

鼠尾膠原蛋白是一種在細胞培養(yǎng)板包被領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛的生物材料，具有優(yōu)越的生物相容性、高拉伸強度、生物可降解性、低抗原性[1]，由于其特有的三重螺旋的氨基酸結(jié)構(gòu)，使其還具有低細胞毒性、促進細胞生長、細胞貼附和遷移等特性，常用于貼壁細胞的培養(yǎng)[2]。鼠尾膠原主要為Ⅰ型膠原蛋白，來源廣泛，制備方便，可作為開發(fā)其他相關(guān)功能性生物材料的原料。

本實驗室自制了大鼠鼠尾膠原，并將其應(yīng)用于小鼠胰島細胞團的培養(yǎng)，進行了培養(yǎng)前后小鼠胰島細胞團形態(tài)、活性的比較，以期獲得其在小鼠胰島細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用，為其在胰島細胞移植中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

一、 材料

1. 實驗動物：SD 大鼠10 只，雌雄不限，體重250 ～300 g；ICR 小鼠20 只，雄性，體重25 ～ 30 g，均由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

2.試劑和實驗器材：膠原酶V、二乙酸熒光素（FD）、碘化吡啶（PI）（Sigma 公司，美國）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；Hanks 、低糖型DMEM 培養(yǎng)基（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；透析袋（分子量2000，美國）；Ficoll-1077 和Ficoll-1119（溫州市怡康細胞移植技術(shù)開發(fā)有限公司）；其余試劑均為分析純。

二、實驗方法

1. 鼠尾生物膠的制備

取健康大鼠尾，75%酒精浸泡15 min，去皮，彎鑷抽出尾腱在無水乙醇中脫水脫脂15 min；取1g，剪成1cm 左右，加入含1M NaCl 的0.05M Tirs/HCl (pH 7.5)溶液20 ml 進行前提??；4℃環(huán)境放置24 h，用Tirs/HCl 和生理鹽水純化；加入0.5M 乙酸400 ml ，4℃下放置4 天；將得到的粗制膠原液用20 %NaCl 液和生理鹽水洗滌純化，得到膠原沉淀物；將膠原沉淀物透析1 天，取膠原液；將精制膠原液5 ml/瓶分裝于玻璃瓶中，冷凍干燥；用0.5M乙酸溶解鼠尾膠原凍干粉末配制成鼠尾膠原蛋白溶液，與DMEM 無糖基礎(chǔ)培養(yǎng)液[3]混合均勻（1:4）后取2 ml注入35 mm 培養(yǎng)皿，用2M NaOH 調(diào)節(jié)pH 至中性；37℃恒溫培養(yǎng)箱放置1 h，得到膠原蛋白凝膠。

2.小鼠胰島的分離純化

采用本實驗室常用的方法分離小鼠胰島[4]，簡述如下：取ICR 小鼠，頸椎脫臼后，逆行膽總管灌注Ⅴ型膠原酶溶液，取下胰腺后37±0.5℃恒溫水浴中振搖消化至泥沙狀，用Ficoll-1119 和Ficoll-1077 密度梯度分離液進行胰島細胞純化；洗滌后的胰島細胞在體視顯微鏡下用移液槍分批挑至兩種胰島細胞培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中與含鼠尾膠的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，以不含鼠尾膠的培養(yǎng)液為對照。

3.胰島的形態(tài)、活性評價

（1）FD-PI 溶液的配制

稱取二乙酸熒光素（FD）2 mg，溶于200 mL 丙酮中，用鋁箔紙包裹4℃避光保存；稱取碘化吡啶（PI）12.5 mg，用25 mL DPBS 溶液溶解，用鋁箔紙包裹-20℃避光保存。

（2）染色及活性計算

取含胰島組織0.5 mL，加入PI、FD 各10 μL，稍混勻后避光室溫下靜置染色30 s 左右，在熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況，死亡的胰島發(fā)紅光，存活的胰島發(fā)綠光；估算紅色細胞占整個細胞團中的比例；數(shù)50 個胰島細胞團的活性，取其平均值即為胰島活性。

4.統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 11.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)

三、結(jié)果

1.大鼠鼠尾膠制備結(jié)果

大鼠鼠尾膠經(jīng)精制和凍干后，得到的結(jié)果如下圖1所示。

圖1 大鼠的鼠尾腱、鼠尾膠凍干后和含鼠尾膠培養(yǎng)液樣品

由圖1 可見，大鼠鼠尾膠處理前為白色的不溶性肌腱（圖1A），經(jīng)過精制和凍干后，可得到白色的海綿狀鼠尾膠蛋白（圖2A），用細胞培養(yǎng)液溶解后的含鼠尾膠細胞培養(yǎng)液澄清透明，溶液略帶膠黏狀（圖1C）。

2.小鼠胰島新分離后的活性結(jié)果

新分離的小鼠胰島呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，胰島邊緣清晰，直徑為50 ～300 μm；將分離純化的胰島經(jīng)FD-PI 染色后，用熒光顯微鏡下觀察，可得胰島的活性為90.2±1.6%，如下圖2A。

3.小鼠胰島與鼠尾膠培養(yǎng)后的活性

將胰島細胞團加至含自制生物膠的胰島細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h 后觀察活性，得到結(jié)果如下圖2B 所示，以胰島細胞與不含生物膠的培養(yǎng)液培養(yǎng)相同時間后的活性做對比（圖2C），結(jié)果如下：

圖2 小鼠胰島細胞經(jīng)自制鼠尾膠膠培養(yǎng)24 h 前后的活性比較（FD-PI 染色）

由上圖結(jié)果可知，培養(yǎng)后的胰島外形依然圓整，邊緣清晰；與培養(yǎng)前的胰島活性相比較，含鼠尾膠的培養(yǎng)液培養(yǎng)后的胰島活性為91.3±1.7%，不含鼠尾膠的培養(yǎng)液培養(yǎng)后的胰島活性為89.6±3.6%，但兩者無統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）。由此可知，含鼠尾膠培養(yǎng)的胰島細胞24n 內(nèi)活性良好。

四、 討論

良好的細胞活性是胰島細胞培養(yǎng)和移植研究的基礎(chǔ)。由本研究可得，本方法制備的鼠尾膠結(jié)合低糖型DMEM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)的胰島細胞團緊實，活性好，可用于培養(yǎng)胰島細胞。

[1] 任海濤, 鐘志勇, 鄭佳琳, 等. 鼠尾膠原蛋白提取、 分離、純化方法的建立及鑒定[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2012,22(11):50-53

[2]Montanez E,Casaroli-Marano RP,Vilaro S.et al.Comparative study of tube assembly in three dimensional collagen matrix and on Matrigel coats[J].Angiogenesis,2002,5(3):167-172.

[3]崔晨威，傅紅興，吳嵐嵐，等.兩種培養(yǎng)液對小鼠胰島細胞培養(yǎng)后的形態(tài)和功能的影響[J].生物技術(shù)世界.2015,(01):69-70.

[4]葉叢叢，傅紅興，江鈴，等.一種快速分離純化小鼠胰島的方法[J].肝膽胰外科雜志.2014，26(5):403-405.