孫喆，劉營，張明輝，李璐，高學(xué)軍

(農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(哈爾濱)，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能

基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱　150030)

轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆外源基因拷貝數(shù)的確定及標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建

孫喆，劉營，張明輝，李璐，高學(xué)軍

(農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(哈爾濱)，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能

基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150030)

摘要：為建立抗逆轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆快速穩(wěn)定的品系特異性檢測方法，本試驗(yàn)通過實(shí)時(shí)Real-time PCR方法，以大豆凝集素基因(lectin)作為內(nèi)源參照基因，確定了外源基因OsDREB3在轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆基因組中的拷貝數(shù)為單拷貝，為建立快速、有效的品系特異性檢測方法奠定基礎(chǔ).同時(shí)，在原有構(gòu)建的含4種轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性序列的標(biāo)準(zhǔn)分子載體上又增加了轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆品系特異性序列，新構(gòu)建了含有5種轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性序列的標(biāo)準(zhǔn)分子及大豆內(nèi)參照基因(lectin)，已完全滿足對現(xiàn)有國內(nèi)覆蓋面最大的5種轉(zhuǎn)基因大豆同時(shí)、快速篩查檢測工作的需要.

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆；外源基因；拷貝數(shù)；標(biāo)準(zhǔn)分子

第一作者：孫喆(1980-)，女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)方面的研究.E-mail:sunzhe1998@163.com

Determination of copy numbers ofOsDREB3 gene

and construction of standard molecular of

transgenicOsDREB3 soybean

SUN Zhe,LIU Ying,ZHANG Ming-hui,LI Lu,GAO Xue-jun

(Superivision and Test Center (Harbin) for Molecular Characteristics of Genetically Modified Plants,

Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Agricultural Genomics,Northeast

Agricultural University,Harbin 150030,China)

Abstract：To establish a fast and stable detection method for OsDREB3,a genetically modified (GMO) soybean,t the exogenous gene OsDREB3 was identified as a single copy gene in the genome by real-time quantitative PCR method and lectin gene as house-keeping gene,which laid a foundation for a rapid and effective detecting method of event specific genetically modified soybeans.At the same time,OsDREB3 event specific sequences were constructed to the multiple-target plasmid,a standard plasmid with four junction regions of genetically modified soybean events,and thus generate a new standard plasmid which can meet fully the demands of rapid detection work of all the five kinds of genetically modified soybeans.

Key words：OsDREB3 transgenic soybean;exogenous gene copy number;standard molecular

自1988年Hinchee首次報(bào)道成功獲得大豆轉(zhuǎn)基因植株以來，1994年美國孟山都公司成功研制出抗草甘膦除草劑轉(zhuǎn)基因大豆(RR大豆)，1995年獲準(zhǔn)在美國商業(yè)化種植，轉(zhuǎn)基因大豆在國際上的種植面積不斷增加[1].我國已經(jīng)成為最大的轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)口國.隨著基因工程技術(shù)的不斷提高，轉(zhuǎn)基因大豆的類型也在不斷增加[2].目前，我國主要轉(zhuǎn)基因大豆類型有‘GTS40-3-2’‘A2704-12’‘A5547-127’‘MON89788’等，農(nóng)業(yè)部已出臺了相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)[3-6].由于地理環(huán)境的因素和優(yōu)越的抗逆性能，抗逆轉(zhuǎn)基因大豆越來越受到科研人員的重視.本研究所用的轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆是從水稻中分離得到的抗逆基因轉(zhuǎn)入到大豆中，以提高大豆的抗逆性狀.近年來，耐低溫抗逆轉(zhuǎn)基因大豆新品系‘OsDREB3’由于優(yōu)秀的抗逆性狀，已進(jìn)入環(huán)境釋放或生產(chǎn)性試驗(yàn)、或獲得安全證書的轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全評價(jià)階段.因此，建立其快速、有效的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)已成為迫切解決的問題.本研究中構(gòu)建的含有轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性基因片段的標(biāo)準(zhǔn)分子，能夠同時(shí)、快速、有效的對5種轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行檢測，獲得的轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆拷貝數(shù)及方法將為我國轉(zhuǎn)基因大豆安全評價(jià)做出一定貢獻(xiàn).

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供；轉(zhuǎn)基因品種大豆‘MON89788’、轉(zhuǎn)基因大豆‘A2704-12’、轉(zhuǎn)基因大豆‘A5547-12’、轉(zhuǎn)基因大豆‘GTS 40-3-2’及非轉(zhuǎn)基因大豆由農(nóng)業(yè)部生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(哈爾濱)提供.

1.2試劑與儀器

dNTP、rTaqDNA聚合酶、Marker DL2000、DNA純化試劑盒，購自Axygen公司；定量PCR試劑盒，pMD18-T質(zhì)粒及所需試劑購自大連寶生物工程有限公司；DNA Clontech Genome WalkerTM Universal Kit.引物合成和測序由Invitrogen公司完成.

PCR儀(德國Biometra，BiometraTgradient)、高速離心機(jī)(上海安亭，TDL-40B)、紫外分光光度儀(美國Beckman，DUR640)、凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP，G8000)、核酸電泳儀(杭州大和熱磁，GE-100)、核酸蛋白分析儀(DU 640，Beckman coulter).

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1DNA提取采用CTAB法，將100 mg樣品經(jīng)預(yù)處理后提取總DNA[7].提取的總DNA溶于100 μL ddH2O中，測定其濃度后最終稀釋成100 ng/μL備用.用紫外分光光度計(jì)測定DNA溶液的D260與D280值，并計(jì)算D260/D280的比值來評價(jià)所提取DNA的質(zhì)量，本研究中所用DNA的D值均在1.9左右.

1.3.2轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆外源基因拷貝數(shù)的確定

1.3.2.1品系特異性PCR引物設(shè)計(jì)以NCBI GeneBank序列為基礎(chǔ).根據(jù)大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin基因序列(GeneBank序列號：K00821)、質(zhì)粒pCAMBIA 1301(GenBank AF234297)和OsDREB3基因序列(GeneBank序列號：AY781349.1)，根據(jù)轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆 5’旁側(cè)序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物[8].質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建及計(jì)算拷貝數(shù)所用引物見表1.

表1　質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建及拷貝數(shù)所用引物序列及擴(kuò)增片段大小

1.3.2.2內(nèi)參基因和外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

1)內(nèi)參lectin標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品選用非轉(zhuǎn)基因大豆做內(nèi)參基因lectin標(biāo)準(zhǔn)對照，進(jìn)行51，52，53，54，55梯度稀釋，經(jīng)過Real-time PCR反應(yīng)，獲得lectin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線.

2)OsDREB3標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建選用含OsDREB3陽性質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)對照，進(jìn)行51，52，53，54，55梯度稀釋，經(jīng)過Real-time PCR反應(yīng)，獲得OsDREB3基因標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.2.3OsDREB3基因拷貝數(shù)的估算為排除其它因素的影響，保證試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)、有效，每個模板做3個平行，進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，獲得內(nèi)參lectin基因Ct值與拷貝數(shù)對數(shù)值的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線和OsDREB3基因Ct值與拷貝數(shù)對數(shù)值的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線，OsDREB3基因與內(nèi)參基因lectin起始量比值即是OsDREB3在大豆基因組中的拷貝數(shù).

1.3.3轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建

1.3.3.1引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)分子所用引物的設(shè)計(jì)以NCBI GeneBank序列為基礎(chǔ).依據(jù)OsDREB3基因序列(GeneBank序列號：AY781349.1)，引物采用Primer 5.0設(shè)計(jì)，新構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)分子所用引物見表2.為了構(gòu)建含有OsDREB3特異片段的標(biāo)準(zhǔn)分子，將OsDREB3外源基因擴(kuò)增后得到的片段大小700bp的特異片段連接到本實(shí)驗(yàn)室自構(gòu)建的商品化轉(zhuǎn)基因大豆陽性對照分子上[9].

表2　新標(biāo)準(zhǔn)分子所用的引物

1.3.3.2陽性標(biāo)準(zhǔn)分子的鑒定以重組質(zhì)粒作為模板，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增條帶.

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆拷貝數(shù)的確定

2.1.1內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)樣品選用非轉(zhuǎn)基因大豆，提取DNA后分別進(jìn)行51，52，53，54，55梯度稀釋，經(jīng)過Real-time PCR反應(yīng)，得到各自的Ct值，通過Ct值與起始模板數(shù)的對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程.lectin基因含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1.轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆內(nèi)參照基因以待檢x為LogDNA分子數(shù)，y為Ct值，建立了內(nèi)參照基因標(biāo)準(zhǔn)曲線.標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示.內(nèi)參照基因lectin標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-2.708x+38.896，R2= 0.995.標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2接近1.

2.1.2OsDREB3基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作制作OsDREB3基因標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品選用OsDREB3表達(dá)載體質(zhì)粒DNA，分別進(jìn)行51，52，53，54，55梯度稀釋，經(jīng)過Real-time PCR反應(yīng)，得到各自的Ct值，通過Ct值與起始模板數(shù)的對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程.OsDREB3基因含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2.轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆外源基因以待檢x為LogDNA分子數(shù)，y為Ct值，建立了外源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示.外源基因OsDREB3基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.679x+42.670，R2= 0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2接近1.

圖1　lectin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　OsDREB3基因含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3OsDREB3基因拷貝數(shù)的計(jì)算采用CTAB法提取基因組，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳(圖3)，顯示基因組無蛋白質(zhì)和RNA污染.

圖3　OsDREB3 DNA基因組凝膠電泳圖

采用絕對定量法計(jì)算轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆中基因邊界序列的拷貝數(shù)，檢測樣品做3個平行，獲得擴(kuò)增曲線，熒光閾值的設(shè)定與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)相同.表3為采用7300分析軟件得到的樣品的Ct值及分子數(shù).拷貝數(shù)的計(jì)算依照公式：拷貝數(shù)=待測品中外源基因分子數(shù)/(待測品中內(nèi)參基因分子數(shù)×2).根據(jù)表4所得Ct值及拷貝數(shù)公式計(jì)算得，轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆拷貝數(shù)為1，即單拷貝.

表3　依據(jù)Lectin、OsDREB3基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線所獲得的樣品Ct值及分子數(shù)

2.2轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建

2.2.1目的基因的擴(kuò)增選擇優(yōu)化好的PCR條件擴(kuò)增轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆的目的基因.目的基因?yàn)楦采w大豆基因組及載體序列的一段特異片段，大小為700 bp(圖4).

2.2.2酶切將OsDREB3質(zhì)粒和原有標(biāo)準(zhǔn)分子經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收，將回收后的OsDREB3基因目標(biāo)片段與實(shí)驗(yàn)室原有標(biāo)準(zhǔn)分子載體進(jìn)行用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和HindⅢ進(jìn)行酶切，可得到大片段的原有標(biāo)準(zhǔn)分子和小片段的OsDREB3特異擴(kuò)增產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見與預(yù)期片斷大小一致的目的基因片段及酶切質(zhì)粒片斷(圖5).

M：DL2000；1：空白；2～3：OsDREB3.

M：DL2000；1：原有標(biāo)準(zhǔn)分子酶切結(jié)果；2：OsDREB3質(zhì)粒酶切結(jié)果.

圖5原有標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)粒和OsDREB3質(zhì)粒經(jīng)

SalⅠ和HINDⅢ酶切后電泳圖

Fig.5Result of original standard molecular plasmid and

OsDREB3 plasmid with enzyme digestion

2.2.3新質(zhì)粒的驗(yàn)證以新構(gòu)建的質(zhì)粒為模板，用不同轉(zhuǎn)基因大豆特異性引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖6所示，條帶清晰，所擴(kuò)增片段大小與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致，表明所構(gòu)建的新標(biāo)準(zhǔn)分子準(zhǔn)確、有效.

M：M：DL-2000；1：GTS40-3-2；2：lectin基因；3：A2704-12；4：A5547-127；5：OsDREB3；6：MON89788.

圖6標(biāo)準(zhǔn)分子目的片段PCR擴(kuò)增

Fig.6PCR amplification of standard molecular fragment

3討論

3.1轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆拷貝數(shù)的確定

在新的轉(zhuǎn)基因植物研究過程中，由于外源基因隨機(jī)插入的數(shù)量影響其表達(dá)，有時(shí)甚至?xí)斐赏庠椿虺聊?因此拷貝數(shù)對于由于外源基因隨機(jī)插入而獲得的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化植株的分子生物學(xué)性狀的研究非常重要.近年來,利用高通量、快速、靈敏的Real-time PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)逐漸受到科研人員的青睞[10-11].獲得轉(zhuǎn)基因植株外源基因拷貝數(shù)的方法很多，如Southern Blot方法就是最常用的轉(zhuǎn)基因植株外源基因拷貝數(shù)獲得方法，此外還有CGH、FISH、Micro array等方法也常用于外源基因拷貝數(shù)的分析.但是這些方法均存在許多不足，例如，對于發(fā)生基因重排的外源基因檢測不夠準(zhǔn)確，需要的DNA模板量多、且檢測時(shí)工作量大并且費(fèi)時(shí)，甚至使用放射性同位素[12-15].Askild[16]采用5’核酸酶PCR方法獲得了轉(zhuǎn)基因玉米MON810拷貝數(shù)為單拷貝，是一種新型的定量方法，較Real-time PCR方法更適合轉(zhuǎn)基因深加工制品.基于Real-time PCR方法建立起來拷貝數(shù)分析方法，具有克服以上各種弊端的優(yōu)點(diǎn).研究發(fā)現(xiàn),雖然在利用Southern雜交和熒光實(shí)時(shí)定量PCR這2種方法檢測轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)時(shí)結(jié)果十分接近，但楊力桃等試驗(yàn)證實(shí)，分別采用Southern Blot方法和Real-time PCR分析方法來確定分析轉(zhuǎn)基因水稻植株中的HPT或GUS基因的拷貝數(shù)時(shí)，結(jié)果顯示定量PCR的方法對于分析轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)更加有效、適用[17-18].因此，本試驗(yàn)選擇Real-time PCR方法來確定轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆的拷貝數(shù).

本試驗(yàn)在分析過程中，樣品設(shè)置3個重復(fù)以盡量減少誤差，以克服Real-time PCR反應(yīng)過程中起始模板數(shù)微小的差異或是反應(yīng)效率的微小變化而導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生較大幅度的偏差.理論上來說，轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆通過Real-time PCR方法得到的基因拷貝數(shù)為1，可能更接近于客觀事實(shí)，因?yàn)橹挥谢蛑嘏挪庞锌赡苡绊懣截悢?shù)的結(jié)果.

3.2轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建

作為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管的重要技術(shù)支撐之一，核酸檢測技術(shù)已成為轉(zhuǎn)基因生物檢測的最主要和常用的方法.而不論采用基于核酸還是蛋白質(zhì)的方法，在轉(zhuǎn)基因生物檢測時(shí)均必須使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(reference materials)作為陽性對照或制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行準(zhǔn)確檢測[19-20].

標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建的原理是將OsDREB3基因轉(zhuǎn)化體特異序列克隆到以pMD18-T為載體的本實(shí)驗(yàn)室陽性標(biāo)準(zhǔn)分子上的HINDⅢ/SalⅠ位點(diǎn)，以此獲得的質(zhì)粒作為定性檢測轉(zhuǎn)GTS40-3-2基因大豆、轉(zhuǎn)MON89788基因大豆、轉(zhuǎn)A5547-127基因大豆、轉(zhuǎn)A2704-12基因大豆以及轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆的新標(biāo)準(zhǔn)分子，以此代替轉(zhuǎn)基因大豆檢測中的陽性對照樣品.

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有一種或多種足夠穩(wěn)定、均一和確定的特性值，用于對設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)、評價(jià)測量方法或?yàn)椴牧隙ㄖ档奈镔|(zhì)和材料.國外研究機(jī)構(gòu)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)較多，購買標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不僅周期長、價(jià)格昂貴，而且在實(shí)際使用中品種不全，不能滿足國內(nèi)日常檢測需求.標(biāo)準(zhǔn)分子(reference molecule)一般包含轉(zhuǎn)基因作物檢測的特異性片段及物種特異的內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因片段，是一種重組質(zhì)粒分子.由于其制備容易、簡便，并可通過細(xì)菌擴(kuò)繁而獲得大量純度較高的DNA樣品，已開始作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測[21].由于操作簡便、生產(chǎn)成本低、容易獲得高純度和高濃度 DNA樣品，且在一個標(biāo)準(zhǔn)分子中可容納多個目標(biāo)序列等突出優(yōu)點(diǎn)，近年來，標(biāo)準(zhǔn)分子被認(rèn)為是解決轉(zhuǎn)基因作物檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的有效途徑之一，已作為新型 DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于轉(zhuǎn)基因作物檢測和定量分析[22-23].

陽性質(zhì)控對照在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測過程中發(fā)揮著監(jiān)控PCR體系工作正常與否的作用，是辨別假陰性和假陽性結(jié)果的重要依據(jù)之一.隨著轉(zhuǎn)基因檢測工作越來越廣泛，對陽性質(zhì)控的需求量也越來越大.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子作為新型陽性質(zhì)控對照，以環(huán)形DNA狀態(tài)存在,可通過寄主菌株無限復(fù)制，且提取純化的方法簡便、用量少，完全能滿足檢測工作需求量[24-26].

近年來，我國有關(guān)轉(zhuǎn)基因作物標(biāo)準(zhǔn)分子的研究開展了許多，得到了許多性質(zhì)穩(wěn)、效率高的轉(zhuǎn)化事件標(biāo)準(zhǔn)分子.如GTS40-3-2、MON89788、MON1445、MON531、MON810、MON863、NK603、Bt11等單個外源基因的轉(zhuǎn)基因作物標(biāo)準(zhǔn)分子[27-30]；敖金霞等[20]構(gòu)建了定性檢測轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻的通用標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)粒；Yang[19]構(gòu)建了含有9種轉(zhuǎn)基因玉米外源基因的標(biāo)準(zhǔn)分子，上述標(biāo)準(zhǔn)分子涵蓋了多數(shù)大規(guī)模商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物，但尚未建立含有轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆轉(zhuǎn)化事件的標(biāo)準(zhǔn)分子.本試驗(yàn)在目前實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的包括所有商品化轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)分子上又構(gòu)建了OsDREB3轉(zhuǎn)化體特異事件，從而完善了現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)分子在OsDREB3抗旱基因檢測方面的不足，為我國建立轉(zhuǎn)OsDREB3基因大豆標(biāo)識管理制度提供參考.

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[6]農(nóng)業(yè)部1861號公告-2-2012．轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑大豆GTS 40-3-2及其衍生品種定性PCR方法[S]．北京:中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2012

[7]農(nóng)業(yè)部1485號公告-4-2010．轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測 DNA提取和純化[S]．北京:中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2010

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(責(zé)任編輯李辛)

收稿日期：2014-06-30；修回日期：2014-07-16

基金項(xiàng)目：轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX08004-002-002)；農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金開放課題項(xiàng)目(NSGJ2012-08).

通信作者：劉營，女，助理研究員，博士，從事轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)方面的研究.E-mail:lyneau@126.com

中圖分類號：Q 78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)03-0061-07