安清明，劉秀，王繼卿，李少斌，胡江，羅玉柱

(甘肅省草食動物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省牛羊基因改良工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)

動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070)

高原綿羊β3-腎上腺素受體基因(ADRB3)變異與適應(yīng)性進(jìn)化分析

安清明，劉秀，王繼卿，李少斌，胡江，羅玉柱

(甘肅省草食動物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省牛羊基因改良工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)

動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

摘要：為了探討ADRB3基因變異及其與高原綿羊適應(yīng)性進(jìn)化關(guān)系，研究以‘甘肅高山細(xì)毛羊’‘藏綿羊’及‘灘羊’3個綿羊品種為觀測對象，采用PCR-SSCP方法檢測ADRB3基因部分內(nèi)含子序列的遺傳多態(tài)性，同時基于DA遺傳距離用NJ法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，明確3個綿羊品種與不同物種群體間的遺傳進(jìn)化關(guān)系.結(jié)果表明：3個綿羊品種共檢測到5種等位基因(A，B，C，D和E)，構(gòu)成了7種基因型(AA，AD，BD，BE，CC，CD和DD)，存在6個突變位點(diǎn)(T/C，C/T，A/G/C，T/C，A/C和T/C),‘灘羊’中未檢測到等位基因A和基因型AA與AD，優(yōu)勢等位基因與基因型在不同群體間各不相同；聚類結(jié)果顯示，不同物種總體上分為2大類，其中綿羊、山羊和家牛等聚為一支，且‘藏綿羊’與‘甘肅高山細(xì)毛羊’之間的遺傳距離最小，‘灘羊’次之；而大猩猩、人和小家鼠聚為一支.研究發(fā)現(xiàn)，ADRB3基因在3個綿羊群體中存在豐富的多態(tài)性，且存在群體間差異.ADRB3基因多態(tài)性豐富的綿羊品種在高海拔地區(qū)適應(yīng)性能力較強(qiáng)， ADRB3基因可能在綿羊適應(yīng)性進(jìn)化中具有一定功能. [3]沈永義.基因組學(xué)與動物適應(yīng)性進(jìn)化研究[C]//2010中國青年遺傳學(xué)家論壇論文匯編.嘉興:中國青年遺傳學(xué)家論壇,2010

關(guān)鍵詞：高原綿羊；ADRB3基因；多態(tài)性；適應(yīng)性進(jìn)化

The variation and adaptive evolution analysis on the

β3-adrenergic receptor gene(ADRB3)

of plateau sheep

AN Qing-ming,LIU Xiu,WANG Ji-qing,LI Shao-bin,HU Jiang,LUO Yu-zhu

(Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology，Gansu Engineering Lab of Genetic

Improvement in Runminants，F(xiàn)aculty of Animal Science and Technology，Gansu

Agricultural University，Lanzhou 730070，China)

Abstract：To study the variations of ADRB3 gene and its relationship with adaptive evolution of plateau sheep,the genetic polymorphhism of part of intron of ADRB3 gene in 3 plateau sheep breed(Gansu Alpine Merino,Tibetan Sheep and Tan Sheep) were detected by PCR-SSCP,NJ tree were constructed by genetic distance (DA) to define the genetic relationship between three sheep and different species groups.The results showed that 6 SNPs (T/C,C/T,A/G/C,T/C,A/C and T/C) corresponding to 5 alleles (A,B,C,D and E) and performing 7 kinds of genotypes (AA,AD,BD,BE,CC,CD and DD) were detected in the intron of ADRB3 gene in 3 plateau sheep breed.The allele D with the frequency of 0.415 9 and genotype CD with the frequency of 0.254 0 were both the highest,and allele A and genotype AA/AD were not detected in Tan sheep.Clustering results showed that different species were divided into two categories,which sheep,goat and cattle populations were clustered together,and the genetic distance between Tibetan Sheep and Gansu Alpine Merino was the smallest,and Tan sheep were smaller.Meanwhile,gorillas,human and mice populations were clustered together.The results of this study showed that the intron of ADRB3 gene has abundant polymorphism in three different populations,and there are rich genetic diversities among different sheep populations.The breeds have stronger adaptive ability in high altitude if the ADRB3 gene has rich variants.Therefore the ADRB3 gene may play a certain role in adaptive evolution in sheep,and the results provided basic data on rational utilize and effective protect plateau special resources.

Key words：plateau sheep;ADRB3 gene;polymorphism;adaptive evolution

分布在青藏高原及毗鄰的川、滇、甘等高寒牧區(qū)的綿羊品種是在高寒、低氧生境下經(jīng)過長期自然選擇和人工選擇而形成的一些高原特有品種，具有耐寒、耐粗飼、抗病力強(qiáng)等特征，如‘藏綿羊’‘甘肅高山細(xì)毛羊’等.近年來由于自然和人為因素的影響，高原綿羊生產(chǎn)性能有所下降，且疾病頻發(fā)[1-2]，合理開發(fā)和保護(hù)高原綿羊種質(zhì)資源迫在眉睫.高原生態(tài)因子是對綿羊種質(zhì)資源開發(fā)利用的主要限制因素.隨著基因組學(xué)的發(fā)展，動物適應(yīng)性進(jìn)化研究也提升到了全基因組水平[3].因此，應(yīng)用分子遺傳學(xué)方法探討藏綿羊高原適應(yīng)性(抗病、高原生態(tài)因子)進(jìn)化機(jī)制，對合理利用和有效保護(hù)特有種質(zhì)資源具有重要意義.

β3-腎上腺素能受體基因(β3-adrenergic receptor，ADRB3)所編碼的β3-腎上腺素能受體對動物的產(chǎn)熱機(jī)能有調(diào)控作用[4-5]，是動物生長性狀的相關(guān)基因[6].綿羊ADRB3基因定位于第10號染色體，總長1.9 kb，由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成[7].ADRB3基因的突變影響動物機(jī)體的產(chǎn)熱機(jī)能.Slee[4]在綿羊育種實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，群體中存在著不同耐寒性的綿羊類群.因此，對動物ADRB3基因多態(tài)性的研究可以發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)對動物生產(chǎn)性能的影響.ADRB3基因的部分內(nèi)含子區(qū)域表現(xiàn)出了高度多態(tài)性，且其多態(tài)性與綿羊的初生質(zhì)量、生長率、屠宰質(zhì)量和耐寒性相關(guān)[6,8].基于ADRB3基因與耐寒性、生長率等特征的相關(guān)性，本研究通過PCR-SSCP分子標(biāo)記技術(shù)對不同綿羊品種ADRB3基因進(jìn)行品種或類群間的系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)一步了解高原綿羊的遺傳多樣性和資源現(xiàn)狀，以及高原綿羊的起源、演化和分類，以期為今后高原綿羊遺傳資源的保護(hù)和利用提供參考.

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究共采集綿羊血樣596份，包括3個綿羊群體(‘甘肅高山細(xì)毛羊’315只，采自甘肅省天祝縣；‘甘南藏綿羊’216只，采自甘肅甘南自治州；‘灘羊’65只，采自甘肅省景泰縣.)每只綿羊頸靜脈采血10 mL，注入到裝有1 mL酸性檸檬酸葡糖糖抗凝劑(acid citrate dextrose，ACD)的采樣管中，置于冰盒中短暫保存，實(shí)驗(yàn)室-20 ℃凍存.

1.2試驗(yàn)方法

采用酚-氯仿抽提法提取綿羊全基因組序列DNA[9].參照GenBank已公布綿羊ADRB3內(nèi)含子序列(Genbank登錄號：AF314201.1)，應(yīng)用Primer 5.0在線設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列為：R：5-CTAGCTCAGTTCTTTCTCTGC-3；F：5-CCCA ACTCCAACCCGACC-3，對綿羊ADRB3基因一段長為263 bp的內(nèi)含子進(jìn)行擴(kuò)增.引物由寶生物(大連)工程有限公司合成.

以提取的DNA為模板，擴(kuò)增2個綿羊品種的ADRB3基因.PCR反應(yīng)體系為：總體積20 μL，其中10×buffer 2 μL，引物各(10 pmol/μL)0.4 μL，DNA模板(50 ng/μL) 0.8 μL，dNTPs (10 mmol/L) 1.5 μL,TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.4 μL ，ddH2O 14.5 μL.PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，35個循環(huán)(94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測.

取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入8 μL變性上樣緩沖液(包括98%去離子甲酰胺、pH為8.0的10 mmol/L EDTA、0.025%二甲苯氰、0.025%溴酚藍(lán))，經(jīng)98 ℃熱變性10 min，立即至于冰盒中，直至點(diǎn)樣.將變性的產(chǎn)物上樣于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=39∶1)，200 V電壓、18 ℃電泳20 h，每次上樣加入5種等位基因樣作為標(biāo)準(zhǔn)樣.結(jié)束后進(jìn)行銀染顯色，判定基因型.

1.3ADRB3基因測序及序列分析

根據(jù)SSCP膠圖分析結(jié)果，選取不同基因型的個體，純合子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測后直接測序；對所檢測到的等位基因只存在于雜合子個體中PCR產(chǎn)物，進(jìn)行克隆純化后測序.基因由北京六合華大基因公司測定.測定結(jié)果經(jīng)MegAlign軟件與GenBank序列進(jìn)行比對.用DISPAN軟件包計(jì)算Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(Nei’s standard genetic distance，DS)和Nei’s遺傳距離(Nei’s genetic distance，DA)[10].基于Nei’s遺傳距離，采用領(lǐng)位相連法(Neighbor-joining)對2個群體進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建，利用Bootstrap Test檢驗(yàn)所得聚類結(jié)果的可靠性.

1.4群體遺傳學(xué)分析

利用Popgen軟件計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)、純合度(Ho)、雜合度(He)及卡方(χ2)檢驗(yàn)，利用PIC軟件計(jì)算多態(tài)性信息含量(PIC).

式中：pi和pj分別為某一特定基因位點(diǎn)上第i和j個等位基因的頻率，n為某一特定基因位點(diǎn)上的等位基因數(shù).

2結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果

基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到的263 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1條特異性較好的電泳條帶(圖1)，由圖1可知，擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期結(jié)果一致，可做后續(xù)的PCR-SSCP分析.

M：DL-500 Marker；1～4：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.

2.2PCR-SSCP檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析，檢測的531只綿羊樣品中共檢測到5種等位基因，分別為A、B、C、D和E ，7種不同基因型，分別為AA、AD、BD、CC、BE、CD和DD.(圖2).

1，8：CC；2，9：BE；3，10：CD；4，11：DD；5：AA；6：AD；7：BD

圖2‘甘肅高山細(xì)毛羊’ADRB3基因不同

基因型PCR-SSCP檢測

Fig.2Detection forADRB3 different genotypes in

Gansu Alpine Merino with PCR-SSCP

2.32個綿羊品種的等位基因頻率和基因型頻率

由表1可知，3個不同綿羊群體ADRB3基因的基因型頻率和等位基因頻率各不相同，但均表現(xiàn)一定的多態(tài)，且各群體間存在差異，‘藏綿羊’與‘甘肅高山細(xì)毛羊’均存在7種基因型，5個等位基因；‘灘羊’中未檢測到等位基因A，基因型AA和AD.其中基因型CD在‘甘肅高山細(xì)毛羊’與‘灘羊’群體中頻率較高，分別為0.254和0.462，而基因型CC在‘藏綿羊’群體中頻率最高，為0.394，可見不同群體中的優(yōu)勢基因型不同，‘甘肅高山細(xì)毛羊’與‘灘羊’群體中等位基因D為優(yōu)勢等位基因，分別為0.415 9和0.392 3，‘藏綿羊’中等位基因C為優(yōu)勢等位基因，為0.435 2.經(jīng)χ2適應(yīng)性檢測，3個綿羊群體均未達(dá)到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.05)，但經(jīng)χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)表明，ADRB3基因的基因型在3個群體間的分布差異顯著(P<0.01)，說明給位點(diǎn)基因型的分布有種間差異.

表1　3種不同綿羊群體ADRB3基因的基因型和等位基因頻率

2.4ADRB3基因的堿基突變與多態(tài)性

由圖3可知，3個綿羊群體ADRB3等位基因與已有綿羊ADRB3基因序列(GenBank登錄號：AF314201.1)具有很高的同源性，本試驗(yàn)檢測到在該序列中存在的6個核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，約占分位點(diǎn)總數(shù)的2.28%，分別為86位T→C，91位C→T，200位A→G/C，216位T→C，231位A→C，233位T→C，其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)為5個，顛換位點(diǎn)2個.

對‘藏綿羊’‘甘肅高山細(xì)毛羊’和‘灘羊’3個綿羊群體的個體進(jìn)行遺傳多樣性分析，包括多態(tài)信息含量(PIC)、雜合度(He)、純合度(Ho)和有效等位基因數(shù)(Ne)等度量群體遺傳多樣性的參數(shù)(表2).

3個綿羊品種的期望雜合度(He)均比較高，都在0.7左右，而純合度較低，均在0.3左右，結(jié)合雜合度與純合度，說明這3個群體遺傳多樣性均較豐富，存在雜種優(yōu)勢，對環(huán)境的有較好的適應(yīng)能力，其中‘藏綿羊’最高，說明‘藏綿羊’的環(huán)境適應(yīng)能力最強(qiáng).PIC數(shù)值高、雜合度大，則說明群體內(nèi)遺傳變異大，遺傳潛力大，可用于動物遺傳育種研究.而PIC>0.5為高度多態(tài)，PIC<0.25為低度多態(tài)，0.5>PIC>0.25為中度多態(tài)，本研究中3個綿羊群體PIC均高于0.5，表現(xiàn)出高度多態(tài)性，表明這3個綿羊品種有豐富的遺傳多態(tài)性，且藏綿羊最高，灘羊最低，這一結(jié)果與3個綿羊品種期望雜合度計(jì)算結(jié)果相一致.

表2　3個綿羊群體ADRB3基因遺傳多態(tài)性分析

2.53個綿羊品種及類群間遺傳特征

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載其他11個不同物種ADRB3基因(不同物種序列號見圖4)與本試驗(yàn)檢測得到的3個綿羊品種的核苷酸序列根據(jù)領(lǐng)位相連法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，由圖4和表3可知‘藏綿羊’和‘甘肅高山細(xì)毛羊’之間的遺傳距離較小(DA=0.011 6，DS=0.011 2)，在NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中聚為一支，NJ系統(tǒng)發(fā)育樹表明本試驗(yàn)中的3個綿羊品種聚為一個分支且與山羊、家牛的遺傳距離較近，而與大猩猩、人類遺傳距離較遠(yuǎn)，這一結(jié)果與這些物種生物學(xué)上的分類一樣，此外，系統(tǒng)發(fā)育樹的Bootstrap Values較高，這2個因素均表明NJ聚類樹具有較好的可靠性.

圖4　不同物種ADRB3基因核苷酸序列構(gòu)建的領(lǐng)接系統(tǒng)樹

藏綿羊甘肅高山細(xì)毛羊?yàn)┭虿鼐d羊-0.01120.0165甘肅高山細(xì)毛羊0.0116-0.0120灘羊0.02340.0130-

對角線右上方為Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(DS)，左下方為Nei’s遺傳距離(DA).

3討 論

通過PCR-SSCP技術(shù)檢測高原綿羊ADRB3基因部分內(nèi)含子序列的遺傳多態(tài)性，共發(fā)現(xiàn)6個SNPs位點(diǎn)(T/C，C/T，A/G/C，T/C，A/C和T/C)，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)占分析總堿基數(shù)的2.28%.其結(jié)果共檢測到5種等位基因，7種不同基因型，這與Byun[8]、Yang[11]和武建亮[12]等對新西蘭和中國部分綿羊品種檢測結(jié)果相似，表明綿羊的ADRB3基因具有較高的遺傳多樣性.本研究檢測到的等位基因和基因型數(shù)相比與Yang[13]對新西蘭和中國部分綿羊品種ADRB3基因檢測的等位基因和基因型數(shù)較少，可能是由于：與所選的綿羊種群、數(shù)量有關(guān)；與綿羊所處的生長環(huán)境有關(guān)，本試驗(yàn)所選的綿羊種群均為高原條件下生長的種群；不同的綿羊品種所經(jīng)受的人工選擇的程度不同，長期進(jìn)行人工選擇的種群與自然條件下繁殖的或只經(jīng)過短期人工選擇的種群的基因的多態(tài)性有一定的差異.3個綿羊品種豐富的多態(tài)性信息含量(PIC>0.6)和較高的期望雜合度(均為0.7左右)表明ADRB3基因多態(tài)性較為分散，即遺傳基礎(chǔ)比較廣泛，因此，ADRB3基因在綿羊品種中具有很好的選育潛能.

解析基因在進(jìn)化過程中受到的選擇作用是研究進(jìn)化生物學(xué)的一個重要方面.通常認(rèn)為，基因在進(jìn)化過程中會受到中性選擇，凈化選擇和適應(yīng)性進(jìn)化的共同作用[14-16]，其中適應(yīng)性進(jìn)化是分子進(jìn)化最為重要的動力，它能夠加速同源蛋白的分化，同時，也是衡量分子適應(yīng)性進(jìn)化的重要標(biāo)準(zhǔn).在DNA水平上檢測適應(yīng)性進(jìn)化的方法主要有距離法、簡約法和最大似然法[16-17]，距離法中可利用單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，基于遺傳距離聚類法中的NJ(neighbor-joining)算法構(gòu)建聚類圖.本試驗(yàn)通過該方法分析不同綿羊品種、綿羊與不同物種之間的遺傳距離，從而分析ADRB3基因的適應(yīng)性進(jìn)化.研究發(fā)現(xiàn)，‘藏綿羊’與‘甘肅高山細(xì)毛羊’之間的遺傳距離最小，與‘灘羊’次之，這可能是由于3種不同的綿羊所生存的環(huán)境有一定的差異，3個綿羊均在高原環(huán)境下生長，但‘藏綿羊’生長環(huán)境為平均海拔4 000 m的青藏高原地區(qū)，而‘甘肅高山細(xì)毛羊’生長在海拔2 600 m左右的地區(qū)，而‘灘羊’生活在低于1 500 m的地區(qū)[18]，且‘藏綿羊’ADRB3基因的變異性最高，‘灘羊’的最低，而‘藏綿羊’在高海拔地區(qū)的適應(yīng)力最好，‘甘肅高山細(xì)毛羊’次之，‘灘羊’最差，這與3個綿羊種群在地理環(huán)境上的分布及生活環(huán)境相同，與本試驗(yàn)NJ聚類分析結(jié)果亦相同.本試驗(yàn)中，通過NJ樹聚類分析，綿羊與山羊遺傳關(guān)系較近，與牛次之，而與其他物較遠(yuǎn)，這與動物的遺傳進(jìn)化一致.因此，本研究結(jié)果可為高原綿羊適應(yīng)性進(jìn)化及合理利用、有效保護(hù)高原綿羊特有種質(zhì)資源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

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(責(zé)任編輯李辛)

收稿日期：2014-04-25；修回日期：2014-05-04

基金項(xiàng)目：國家國際科技合作專項(xiàng)(2011DFG33310)；教育部博士點(diǎn)基金(20116202110001)；甘肅省青年科技基金(1208RJYA043)；甘肅省科技支撐計(jì)劃(1104JKCA107)；甘肅省創(chuàng)新研究群體計(jì)劃(1210RJIA005).

通信作者：羅玉柱，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代生物技術(shù)與動物育種應(yīng)用.E-mail：luoyz@gsau.edu.cn

中圖分類號：第一作者：安清明，男，博士研究生，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代生物技術(shù)與動物育種.E-mail:anqingming2009@163.com