實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力動(dòng)物模型研究

王銀萍1，陳靜2，林海嬌1，衣春光3，王健1*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,長(zhǎng)春 130021;2.長(zhǎng)春市中醫(yī)院,長(zhǎng)春 130022;

3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),長(zhǎng)春 130117)

摘要：研究表明，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力(EAMG)與重癥肌無(wú)力(MG)在癥狀、病理、免疫及組織學(xué)方面相似。EAMG動(dòng)物模型主要通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備與重癥肌無(wú)力患者的臨床表現(xiàn)、免疫組織學(xué)、電生理學(xué)等相似的動(dòng)物模型，為臨床診斷及治療提供依據(jù)。但目前EAMG模型仍不完善，仍需進(jìn)一步探索。

關(guān)鍵詞：自身免疫性重癥肌無(wú)力；實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停粚?shí)驗(yàn)研究

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2015.06.068

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-6258(2015)06-1282-04

基金項(xiàng)目：吉林省教育廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(吉教科合字[2011第58號(hào)]);吉林省教育廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(吉教科合字[2012第62號(hào)]);吉林省教育廳“十一五”規(guī)劃項(xiàng)目(吉教科合字[2010第54號(hào)])；吉林省科技廳中藥辦項(xiàng)目(20110933)。

作者簡(jiǎn)介：王銀萍(1984-)，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)內(nèi)科研究。

收稿日期:(2015-09-20)

*通信作者：王健，主任醫(yī)師，電話-15948000772，電子信箱-jian-wang222@163.com

Experimental autoimmune myasthenia gravis animal models

WANG Yinping1，CHEN Jing2，LIN Haijiao1，YI Chunguang3，WANG Jian1*

(1.Affiliated hospital of Changchun university of Chinese medicine, Changchun 130021, China;

2. Changchun Chinese medicine hospital, Changchun 130022, China;

3. Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Abstract：Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis (Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis, EAMG) animal model mainly through active or passive immunization of Experimental animals, the preparation and clinical manifestation of patients with Myasthenia Gravis, immune histology, electrophysiology and other similar animal models, which provide the basis for clinical diagnosis and treatment. But currently EAMG model is still not perfect, still need to be solved.

Keywords：EAMG；experimental model；experimental research

重癥肌無(wú)力(MG)是一種神經(jīng)-肌肉接頭處傳遞障礙的獲得性自身免疫性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，本病的發(fā)病率為8～20/10萬(wàn)[1]，且近年來(lái)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，以老年人為著[2]。為進(jìn)一步研究本病的發(fā)病機(jī)制及治療方法，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)越來(lái)越被關(guān)注[3-5]。筆者現(xiàn)將近幾年有關(guān)本病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽渥饕魂U述。

1EAMG的免疫方式

1.1主動(dòng)免疫法1.1.1以AchR蛋白為免疫原目前最為經(jīng)典的造模方法[6]主要是從丁(氏)雙鰭電鰩的電器官分離乙酰膽堿受體(AchR)，通過(guò)Folin酚試劑法及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)提取AchR的含量及活性；以提取的AchR與完全福氏佐劑(CFA)充分混合,分別于實(shí)驗(yàn)大鼠的足墊、腹部及背部皮下多點(diǎn)注射乳劑1.5 mL，第4周再次注射上述乳劑免疫大鼠。CFA對(duì)照組只接受等量CFA皮下注射 。此種造模方法是目前最為經(jīng)典、成模率最高的一種實(shí)驗(yàn)方法，延續(xù)至今，目前仍有學(xué)者應(yīng)用這一造模方法[7]。但是在實(shí)際中卻難以操作，原因是由于雙鰭電鰩本身稀有，難以捕獲，并且從中提取AchR過(guò)程復(fù)雜，因此在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中存在著一定的困難，難以推廣使用。1.1.2以人工合成的AChR-α亞基多肽為免疫原AChR是由2個(gè)α、1個(gè)β和1個(gè)γ亞基組成，3個(gè)亞基各有其生理功能，但α亞基是引起MG的抗原決定簇。隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，目前市場(chǎng)上已經(jīng)存在多種人工合成的AchR的α亞基多肽，電鰩中提取AchR的α亞基多肽代價(jià)太高，人工多肽逐漸被醫(yī)學(xué)界接受。目前使用最多的人工多肽[8]：鼠源性乙酰膽堿受體α亞基97-116肽段、α138-167肽段、α125-147肽段、α129-145肽段、α1-210肽段等，其免疫過(guò)程與徐浩鵬等[6]實(shí)驗(yàn)方法基本一致。近10年的實(shí)驗(yàn)研究主要側(cè)重此實(shí)驗(yàn)試劑及方法，而近5年的實(shí)驗(yàn)研究更少。但從文獻(xiàn)報(bào)道中顯示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型例數(shù)較少，大多30只左右，缺少大批量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。筆者通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)研究，分別采用人工鼠源性乙酰膽堿受體α亞基97-116肽段、α129-145肽段進(jìn)行免疫Lewis大鼠，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照徐浩鵬等[6]實(shí)驗(yàn)方法操作,但最終成模率不足30%,顯示人工合成的AchR的α亞基多肽誘導(dǎo)EAMG成功率并不理想。最新文獻(xiàn)報(bào)道[9]，使用AchR(m97-116)肽段-CD205融合單鏈抗體進(jìn)行免疫C57雌性小鼠共2只，成模率100%，但數(shù)量減少，有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。1.2被動(dòng)免疫法1.2.1采用MG患者血清中AchR抗體MG被動(dòng)免疫小鼠模型的制備，采用未進(jìn)行手術(shù)或未使用激素及免疫抑制劑治療的陽(yáng)性血清患者(SPMG)，正常人的血清為陰性血清(SNMG)，每日分別在小鼠腹腔內(nèi)注射SNMG或SPMG患者血清0.6 mL，連續(xù)7 d。所有小鼠在注射血清后24 h腹腔注射環(huán)磷酰胺(30 mg/kg)以抑制免疫反應(yīng)[10]。 SCHONBECK等[11]通過(guò)胸腺移植建立EAMG，通過(guò)移植MG患者的胸腺組織至嚴(yán)重免疫缺陷小鼠腎被膜下1~2周后，在實(shí)驗(yàn)小鼠血清中可檢測(cè)到抗人AchR-Ab，11周時(shí)抗人AchR-Ab滴度可升高至重度MG水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MG患者的胸腺組織可以誘導(dǎo)EAMG。由于MG患者血清中存在各種異常的免疫蛋白及炎癥介質(zhì)，所以在模型制備過(guò)程中是否存在干擾，目前無(wú)人研究，故此種造模方法尚不能被多數(shù)醫(yī)家接受。1.2.2 采用乙酰膽堿受體單克隆抗體建立動(dòng)物模型此實(shí)驗(yàn)方法選擇的主要抗體是乙酰膽堿受體(nAchR)單克隆抗體mAb35，主要是通過(guò)mAb35注射C57BL/6幼年小鼠腹腔內(nèi)進(jìn)行免疫。具體實(shí)驗(yàn)方案：健康清潔級(jí)雌性C57BL/6小鼠48只，4～5周齡，體質(zhì)量12～14 g,參照文獻(xiàn)[12]將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組(E)和對(duì)照組(N)，實(shí)驗(yàn)組分為3組(El、E2、E3)，每組12只。分別經(jīng)腹腔注射含0.5、1.0、1.5 mg/kg mAb35的Ringer’s液0.2 mL給B6幼年小鼠，對(duì)照組(N)注射不含mAb35的Ringer’s液0.2 mL[13]，3 d后各組小鼠出現(xiàn)不同程度的肌無(wú)力表現(xiàn)，重者可導(dǎo)致呼吸肌無(wú)力而死亡 。雖然該實(shí)驗(yàn)方法成模率較高，成模速度快，但臨床癥狀消失也快，不符合人類的患病特點(diǎn)，故該實(shí)驗(yàn)方法難以被廣泛應(yīng)用。1.2.3基因疫苗免疫小鼠建立重癥肌無(wú)力動(dòng)物模型郝志波等[12]用基因疫苗pcDNA2AchRɑ211免疫C57BL/6小鼠建立 EAMG。方法是將人乙酰膽堿受體α亞基N端的主要免疫區(qū)(AChRa 211)的基因片段插入到穿梭載體pcDNA3．0中，構(gòu)建基因疫苗pcD-NA2AChRɑ211。大量提純質(zhì)粒pcDNA2AChRɑ211后肌肉注射C57BL/6小鼠。用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中抗AChRa 211的AChR-Ab，并用PCR方法檢測(cè)外源基因在小鼠各組織器官中的分布情況。該實(shí)驗(yàn)方法成功率較高，表現(xiàn)較好，但由于該實(shí)驗(yàn)中需要從MG患者中提取AChRa 211基因片段，過(guò)程復(fù)雜，要求科技水平較高，實(shí)際操作中存在著一定的困難。

2模型成功標(biāo)準(zhǔn)

2.1臨床癥狀首先可以通過(guò)測(cè)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量來(lái)評(píng)估，即實(shí)驗(yàn)前及接種后每2周稱重1次。另外可以通過(guò)測(cè)量肌力來(lái)評(píng)估，對(duì)于輕度肌無(wú)力者可通過(guò)疲勞試驗(yàn)來(lái)評(píng)估，連續(xù)讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重復(fù)抓握籠頂30 s再測(cè)量。分級(jí)方法可采用Lennon進(jìn)行評(píng)分，0級(jí):沒有肯定的肌無(wú)力表現(xiàn)；1級(jí):撕咬無(wú)力，四肢力量差，在光滑地面上前肢打滑，活動(dòng)減少，且容易疲勞；2級(jí)：明顯無(wú)力，在抓握前就出現(xiàn)震顫、低頭、隆背、抓握力弱；3級(jí)：在抓握前即有嚴(yán)重的肌無(wú)力表現(xiàn)、無(wú)力抓握、瀕死狀態(tài)；4級(jí)：死亡。2.2新斯的明試驗(yàn)法[14]予新斯的明(37.5 μg/kg)和硫酸阿托品(15 μg/kg)分別于大鼠腹腔注射,12 min后成功模型組大鼠可表現(xiàn)為無(wú)力癥狀明顯好轉(zhuǎn)，但一般可持續(xù)2～12 h。2.3低頻重復(fù)電刺激檢查電衰減反應(yīng)陽(yáng)性[15]將麻醉后的小鼠仰臥固定在解剖板上，將其下肢解剖，分離出腓腸肌及跟腱，然后將肌電圖的電極一根插入腓腸肌內(nèi)側(cè)頭,另一根插入跟腱皮下,給予3~5 HZ、連續(xù)10次的低頻電刺激,成功實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?jīng)刺激后肌電圖應(yīng)呈現(xiàn)為腓腸肌電位及收縮波幅呈衰減波形。2.4測(cè)定血清中AchR-ab的含量通過(guò)眼球取血法，將血離心分離血清，分裝后-80 ℃保存待測(cè)，采用ELISA法檢測(cè)，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，在酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)為450 nm處測(cè)定A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀出抗體水平。2.5AChR數(shù)目的計(jì)算將正常組及模型組大鼠腓腸肌溶于l%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100 中，分別加入過(guò)量125Ⅰ標(biāo)記α-銀環(huán)蛇毒的磷酸鹽緩沖液，孵育1～3 h后加入過(guò)量兔抗鼠 IgG，所得沉淀物用磷酸鹽緩沖液沖洗2遍，用γ-計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，再用標(biāo)準(zhǔn)曲線求取已結(jié)合抗體的 AChR數(shù)。成功的重癥肌無(wú)力模型大鼠肌肉中的AChR數(shù)目與正常大鼠比較明顯減少[16]。2.6光鏡將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死，迅速取出腓腸肌，使用多聚甲醛固定，石蠟包埋，辣根氧化酶孵育切片1 h，用磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗3次，再用聯(lián)苯二胺雙氧水在室溫下顯色，最后在光鏡下觀察運(yùn)動(dòng)終板上AChR數(shù)目的改變。成功模型組光鏡下可見到EAMG動(dòng)物神經(jīng)末梢和肌纖維處有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肌細(xì)胞呈節(jié)段性壞死，運(yùn)動(dòng)終板上AchR數(shù)目減少 。2.7電鏡與光鏡不同的是電鏡使用高碘酸鹽2賴氨酸 2多聚甲醛(PLP)液固定2 h后沿肌纖維走行切成 0.15 cm×0.15 cm×1.1 cm大小塊，用PBS沖洗后再放入辣根氧化酶中，于4 ℃孵育2 h，再用 PBS洗凈，以聯(lián)苯二胺雙氧水顯色。最后在立體顯微鏡下尋找神經(jīng)肌肉接頭的部位，使用戊二醛及鋨酸固定、脫水、環(huán)氧類樹脂包埋、切片，經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后使用電鏡觀察。電鏡下顯示[17]成功模型組模型突觸后膜皺褶退化，突觸間隙加寬。

3小結(jié)

重癥肌無(wú)力屬于世界疑難性疾病，發(fā)病率較高，但治療局限，僅限于激素、免疫抑制劑、血漿置換，療效不盡人意，最終給家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。中醫(yī)藥治療本病療效顯著，但其作用靶點(diǎn)仍缺乏大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)證據(jù)。研究表明,EAMG與MG在癥狀、病理、免疫及組織學(xué)方面相似，因此越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)研究逐漸被重視。經(jīng)典的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪亲匀惶崛‰婗幹蠥chR蛋白進(jìn)行免疫Lewis大鼠,成模率較高，但其制備過(guò)程難度高，且電鰩稀有，費(fèi)用昂貴，因此該實(shí)驗(yàn)方法難以推廣應(yīng)用；人工合成的AchR蛋白倍受醫(yī)學(xué)界歡迎，但通過(guò)搜索資料及實(shí)驗(yàn)研究表明，應(yīng)用人工合成的AchR蛋白進(jìn)行免疫的實(shí)驗(yàn)方法仍較多，但缺少大量成功模型的研究，并且有關(guān)EAMG的實(shí)驗(yàn)方法越來(lái)越少。因此，成功制備EAMG模型仍是醫(yī)學(xué)工作者亟待解決的問題。

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