陳瀟雨，張威，屈穎偉，王鎖剛

（1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450000）

·論著·

膜聯(lián)蛋白Ⅱ反義寡核苷酸對(duì)人膀胱癌BIU-87細(xì)胞膜聯(lián)蛋白Ⅱ表達(dá)及細(xì)胞侵襲力的影響

陳瀟雨1，張威2，屈穎偉1，王鎖剛1

（1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450000）

目的探討膜聯(lián)蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ）反義寡核苷酸（ASODN）對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞AnnexinⅡ基因表達(dá)及侵襲力的影響。方法設(shè)計(jì)合成AnnexinⅡASODN，采用脂質(zhì)體將低、中及高濃度（6、12及18μmol/L）的AnnexinⅡASODNs分別轉(zhuǎn)染BIU-87細(xì)胞24、48及72 h，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（不轉(zhuǎn)染）。采用免疫細(xì)胞化學(xué)與原位雜交法分別檢測(cè)各組細(xì)胞中AnnexinⅡ蛋白與mRNA的表達(dá)；采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，采用Boyden chamber侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高濃度轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞侵襲力情況。結(jié)果與空白對(duì)照組相比，各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞AnnexinⅡ蛋白和mRNA的表達(dá)均減弱，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且AnnexinⅡ蛋白及mRNA的表達(dá)隨AnnexinⅡASODN濃度的增加及轉(zhuǎn)染時(shí)間的延而減弱（P<0.05）；AnnexinⅡASODN轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯增加（P<0.05）；細(xì)胞穿越Matrigel的細(xì)胞數(shù)交空白組減少，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論AnnexinⅡASODN可有效抑制膀胱癌BIU-87細(xì)胞AnnexinⅡ蛋白及mRNA的表達(dá)，抑制BIU-87細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲力。

膜聯(lián)蛋白Ⅱ；反義寡核苷酸；BIU-87細(xì)胞；侵襲力

膜聯(lián)蛋白（Annexin）Ⅱ?qū)儆谀ぢ?lián)蛋白家族，參與信息轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA的合成、細(xì)胞骨架活動(dòng)、細(xì)胞遷移及細(xì)胞增殖等[1-2]。研究表明，AnnexinⅡ基因的表達(dá)失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-5]，已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。作者利用反義寡核苷酸技術(shù)轉(zhuǎn)染膀胱癌BIU-87細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞AnnexinⅡ基因表達(dá)及細(xì)胞侵襲力的影響，從而為分子靶向治療膀胱癌的提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱癌BIU-87細(xì)胞株由北京大學(xué)泌尿外科研究所惠贈(zèng)，體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPM I 1 640培養(yǎng)液購(gòu)上?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限（北京）公司，Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，全硫代修飾Annexin的反義寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODN）（5'-ACACATCT GGTGACTTCCGCAA-3'）及AnnexinⅡmRNA生物素標(biāo)記探針（5’-GGCCAATGTGTTCAACCAAGCGG -3’）由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，兔抗人AnnexinⅡ多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，PV-9000二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，預(yù)雜交液、核固紅購(gòu)自武漢博士德公司，堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親和素（alkaline phos phatase strep tavidin，APS）和5-溴-4-氯-3吲哚磷酸/顯色原硝基四氯唑藍(lán)（BC IP/NBT）購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Matrigel膠購(gòu)于BD biosciences公司。

1.2 細(xì)胞分組培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

復(fù)蘇后的BIU-87細(xì)胞于RPMI 1 640培養(yǎng)液（含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，青霉素100 u/L，鏈霉素100 u/L），37℃、5%二氧化碳CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后消化、以細(xì)胞數(shù)8×105/孔接著24孔培養(yǎng)板空培養(yǎng)。用Lipofecter脂質(zhì)體將6μmol/L（低濃度）、12μmol/L（中濃度）及18μmol/L（高濃度）的AnnexinⅡASODN轉(zhuǎn)染BIU-87細(xì)胞24、48及72 h，并設(shè)空白對(duì)照組（不轉(zhuǎn)染）。

1.3 細(xì)胞滴爬片的制備

按實(shí)驗(yàn)要求消化、收集24孔板中各組細(xì)胞，制成3.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取100μL細(xì)胞懸液滴到載玻片（經(jīng)清洗、泡酸及高壓消毒）上，放入濕盒，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～9 h，待細(xì)胞貼壁后晾干，40 g/L多聚甲醛固定，4℃冰箱保存。

1.4 AnnexinⅡ蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)

參照PV9000二步法免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以PBS代替一抗為陰性對(duì)照，以已知AnnexinⅡ陽(yáng)性表達(dá)的肝癌組織切片為陽(yáng)性對(duì)照。AnnexinⅡ蛋白陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于100個(gè)。按陽(yáng)性細(xì)胞百分比及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定[6]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①陽(yáng)性細(xì)胞百分比<1%為0分，～25%為1分，～50%為2分，～75%為3分，>75%為4分。②細(xì)胞顯色為0分，淡黃色為1分棕黃色為2分，棕褐色為3分。上述2種評(píng)分結(jié)果相乘，以積分值表示AnnexinⅡ蛋白的表達(dá)水平。

1.5 AnnexinⅡmRNA的原位雜交法檢測(cè)

參照原位雜交試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以不含探針的預(yù)雜交液孵育的組織切片作陰性對(duì)照，用已知AnnexinⅡ陽(yáng)性表達(dá)的肝癌組織作陽(yáng)性對(duì)照。AnnexinⅡ原位雜交陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈藍(lán)紫色。高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于100個(gè)。按陽(yáng)性細(xì)胞百分比及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定[6]。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%、～30%、～70%和>70%分別記為1、2、3和4分。按雜交信號(hào)強(qiáng)度分為弱、中和3級(jí)，分別記為1、2和3分。上述2種評(píng)分結(jié)果相乘，以積分值表示AnnexinⅡmRNA的表達(dá)水平。

1.6 四唑鹽比色試驗(yàn)（MTT法）檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

96孔板收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每空加入20μl MTT溶液和150μl二甲基亞砜后，按實(shí)驗(yàn)要求處理細(xì)胞并培養(yǎng)至各時(shí)間點(diǎn)，酶標(biāo)儀檢測(cè)各空光密度（D）值（λ=490 nm），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取均值，每組檢測(cè)10次。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（1–轉(zhuǎn)染組D/對(duì)照組D）×100%。

1.7 Boyden chamber侵襲小室實(shí)驗(yàn)

于6孔培養(yǎng)板中置放小室，用聚碳酸酯膜將上下室分開(kāi)，膜上鋪設(shè)人工基底膜Matrigel 120 g/室（取50μl無(wú)血清1 640培養(yǎng)基用來(lái)稀釋），37℃環(huán)境中放置30～60 min，使其形成凝膠狀，可以仿制人體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜環(huán)境。再次使用無(wú)血清1640培養(yǎng)基沖洗2次。將高濃度轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染72 h及相應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞懸液稀釋成濃度為5×105個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液；每個(gè)小室加400μl稀釋好的各組單細(xì)胞懸液，每組細(xì)胞加3個(gè)小室；常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h；取出小室，用棉簽小心擦凈膜上室面的膠和細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色后，細(xì)胞面朝上貼附到載玻片上；顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍（400×）視野內(nèi)的穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；多組均數(shù)的比較均用方差分析，方差不齊時(shí)可用變量轉(zhuǎn)換來(lái)處理；兩組組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各種細(xì)胞AnnexinⅡ蛋白的表達(dá)

不同濃度AnnexinⅡASODN轉(zhuǎn)染組AnnexinⅡ蛋白的表達(dá)均低于對(duì)照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；不同濃度及不同轉(zhuǎn)染時(shí)間AnnexinⅡASODN轉(zhuǎn)染組間兩兩相比，AnnexinⅡ蛋白表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨濃度的增加、轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。見(jiàn)表1、圖1。

2.2 各組細(xì)胞AnnexinⅡmRNA的表達(dá)

不同濃度AnnexinⅡASODN轉(zhuǎn)染組細(xì)胞An nexinⅡmRNA的表達(dá)均低于對(duì)照組（P<0.05），且不同濃度及不同轉(zhuǎn)染時(shí)間AnnexinⅡASODN轉(zhuǎn)染組間兩兩相比，mRNA表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨濃度的增高、時(shí)間的增加而減弱。見(jiàn)表2、圖2。

2.3 各種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較

不同濃度AnnexinⅡASODN分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞24、48及72 h，各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均高于空白對(duì)照組（均P<0.05），細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨轉(zhuǎn)染濃度的增高、轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，且不同濃度及不同轉(zhuǎn)染時(shí)間各組兩兩相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P <0.05），見(jiàn)表3。

2.4 Boyden chamber體外侵襲試驗(yàn)

AnnexinⅡASODN組細(xì)胞穿越Matrigel的細(xì)胞數(shù)少于空白對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表4、圖3。

圖1 3種不同濃度AnnexinⅡ轉(zhuǎn)染72 h后，各種細(xì)胞AnnexinⅡ蛋白的表達(dá)（PV，400×）

圖2 3種不同濃度AnnexinⅡ轉(zhuǎn)染72 h后，各組細(xì)胞AnnexinⅡmRNA的表達(dá)（BCIP/NBT，400×）

圖3 Boyden chamber體外侵襲實(shí)驗(yàn)

表1 AnnexinⅡASODN對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞AnnexinⅡ蛋白的影響（±s）

表1 AnnexinⅡASODN對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞AnnexinⅡ蛋白的影響（±s）

組別24 h48 h72 hF值P值低濃度組5.98±0.465.14±0.484.36±0.538.1720.019中濃度組4.75±0.514.12±0.513.22±0.447.4560.024高濃度組空白對(duì)照組4.18±0.55 6.87±0.85 3.08±0.45 7.32±0.92 2.75±0.51 7.11±0.76 6.595 0.231 0.031 0.800 F值14.86043.12058.921 P值0.0020.0000.000

表2 AnnexinⅡASODN對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞AnnexinⅡmRNA的影響（±s）

表2 AnnexinⅡASODN對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞AnnexinⅡmRNA的影響（±s）

組別24 h48 h72 hF值P值低濃度組5.58±0.555.12±0.494.72±0.781.4480.307中濃度組4.86±0.524.07±0.523.88±0.652.5240.160高濃度組空白對(duì)照組3.54±0.57 6.69±0.43 2.85±0.43 6.82±0.61 2.45±0.54 6.92±0.86 3.414 0.092 0.102 0.913 F值32.61553.67934.342 P值0.0000.0000.000

表3 各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較（n=30±s）

表3 各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較（n=30±s）

組別抑制率/%F值P值24h48h72h空白對(duì)照組0.80±0.210.19±0.250.20±0.180.120.892低濃度處理組1.65±0.10 22.60±0.59 31.30±4.05 76.77<0.001中濃度處理組7.12±0.22 28.31±3.55 41.66±4.10 78.14<0.001高濃度處理組F值P 21.63±2.78 138.81 <0.001 45.89±3.88 182.02 <0.001 57.00±5.62 152.66 <0.001 49.87<0.001

表4 Boyden chamber體外侵襲試驗(yàn)結(jié)果（±s）

表4 Boyden chamber體外侵襲試驗(yàn)結(jié)果（±s）

組別穿膜細(xì)胞數(shù)ASODN組72.26±2.97空白對(duì)照組174.91±3.27 t值36.808 P值0.000

3 討論

目前，治療膀胱癌的主要方法主要是手術(shù)及術(shù)后化療藥物灌注，因膀胱癌的復(fù)發(fā)率高，致使不少患者反復(fù)手術(shù)，術(shù)后患者生活質(zhì)量往往較差。近年來(lái)，對(duì)膀胱癌的診治水平有了很大的提高，但是淺表性膀胱腫瘤在復(fù)發(fā)率仍然居高不下，特別是晚期膀胱癌的預(yù)后依然較差，膀胱癌患者的死亡率呈逐年增加趨勢(shì)。所以，尋求治療膀胱癌的新方法是目前研究的熱點(diǎn)。

AnnexinⅡ是Annexin家族成員之一，Annexins是一類鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞增殖、分泌、纖溶和細(xì)胞骨架連接等重要的生物學(xué)功能，但其確切的作用機(jī)制目前尚不十分明了。多項(xiàng)研究表明[7-9]，AnnexinⅡ在細(xì)胞增殖中起重要作用，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，且其表達(dá)與年齡、組織分化、病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。有研究表明，AnnexinⅡ具有促進(jìn)腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的作用，可能與其是組織型纖溶酶原激活物、纖溶酶原及細(xì)胞粘合素C的受體有關(guān)[10]。AnnexinⅡ能夠與纖溶酶、纖溶酶原、組織型纖溶酶原激活物、組織蛋白酶B、細(xì)胞黏合素C及細(xì)胞外基質(zhì)等相互作用，它們均與腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過(guò)AnnexinⅡ使以上多種蛋白酶及其底物在腫瘤細(xì)胞表面共區(qū)域化（colocalization），因此可降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫離，造成遷移、侵犯局部組織或器官[11]。

反義核酸技術(shù)是近年來(lái)在基因治療研究中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，通過(guò)堿基配對(duì)原則在細(xì)胞內(nèi)與特異性靶mRNA序列相結(jié)合，以干擾靶mRNA由細(xì)胞核向細(xì)胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)、促進(jìn)RNA酶降解靶mRNA以及抑制相應(yīng)蛋白質(zhì)的翻譯，從而干擾靶基因的表達(dá)，甚至完全阻斷。本研究采用反應(yīng)寡核苷酸技術(shù)，將AnnexinⅡASODN轉(zhuǎn)染膀胱癌BIU-87細(xì)胞，結(jié)果表明，AnnexinⅡASODN可明顯抑制膀胱癌BIU-87細(xì)胞AnnexinⅡ基因蛋白及mRNA的表達(dá)，且具有濃度及時(shí)間依賴性；AnnexinⅡASODN可明顯抑制膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，另外，Boyden chamber實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AnnexinⅡASODN可抑制膀胱癌BIU-87細(xì)胞的侵襲力，所以，應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)通過(guò)抑制AnnexinⅡ基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，達(dá)到治療腫瘤的目的成為可能，為臨床治療膀胱癌提供了新思路。

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Effect of AnnexinⅡASODN on the expression of AnnexinⅡgene and invasion of human bladder cancer BIU-87 cell

Xiao-yu CHEN1,Wei ZHANG2,Ying-wei QU1,Suo-gang WANG1
(1.Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou,Henan 450000,P.R.China;2.Department of Pathology,the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450000,P.R.China)

【Objective】To explore the effect of AnnexinⅡASODN on the expression of AnnexinⅡgene and invasion in human bladder cancer BIU-87 cells.【Methods】The oligonucleotide of AnnexinⅡASODN were designed firstly.Three different concentrations of AnnexinⅡASODN(6,12 and 18 μmol/L was used to transfect BIU-87 cells with different time exposure(24,48 and 72 h),and the control group were established accordingly by no transfection.The level of mRNA and protein of AnnexinⅡin the 6 groups were measured by insitu hybridization and immunocytochemistry.MTT method was used to detect the cell prolife ration and Boyden chamber invasion was used to detect t the BIU-87 cell invasion.【Results】Compared with the control groups,there were significant differences in the expressions of AnnexinⅡmRNA and protein of BIU-87 cells among the 3 groups at 24,48,and 72 h(P< 0.05),and increased with the increase of siRNA concentration and time exposure(P<0.05).Compared with the control groups,the growth inhibition rate of BIU-87 cells transfected with AnnexinⅡASODN for different time exposure was higher(P<0.05),and increased with the increase of ASODN concentration and time exposure(P<0.05).Compared with the control group,AnnexinⅡASODN group can inhibit the invasion force of bladder cancer BIU-87 cell, and the differences were statistically significant(P<0.05).【Conclusion】AnnexinⅡASODN could effectively knockdown the expression of AnnexinⅡ,which could significantly inhibit the invasion force of bladder cancer BIU-87 cell.

AnnexinⅡ;ASODN;bladder cancer BIU-87 cells;invasion

1005-8982（2015）34-0010-05

R737.14

A

2015-02-12

王鎖剛，E-mail：wangsuogang2005@126.com