趙晴瀟，魏 群

(東北電力大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林吉林132012)

α－半乳糖苷酶也稱蜜二糖酶，屬于外切糖苷酶類，加水可以分解蜜二糖［1］。α－半乳糖苷酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，不同來源的α－半乳糖苷酶其理化特性相差明顯。以植物(咖啡、車前草、蠶豆、西瓜)取材的α－半乳糖苷酶研究得較多。在各種哺乳動物組織勻漿中也存在α－半乳糖苷酶，以人和鼠的甲狀腺、腎臟和脾臟的酶活最高。微生物來源的α－半乳糖苷酶研究的也比較深入。特別是絲狀真菌α－半乳糖苷酶由于其合適的pH、良好的穩(wěn)定性、細胞外分泌和表達量較高的特點而成為研究的熱點。但當(dāng)前國內(nèi)外學(xué)者對于不同來源α－半乳糖苷酶的研究發(fā)現(xiàn)，無論是從動植物、微生物或者采用其它技術(shù)手段獲得的α－半乳糖苷酶均存在著如下兩個問題:一是該酶的提取工藝復(fù)雜，耗費大量生產(chǎn)成本，為該酶在工業(yè)上大量應(yīng)用的一個弊端;二是普遍酶活性不高，固定化后活力進一步下降，導(dǎo)致重復(fù)使用的困難，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)中特殊要求［2－5］。本實驗試圖篩選一株具有高酶活的產(chǎn)α－半乳糖苷酶菌株并對其固定化研究，以求解決這一問題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑

泡菜汁(市售)、對硝基苯α－D－半乳糖苷和對硝基酚、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X－α－Gal)、棉子糖。

1.1.2 主要儀器

離心機、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、數(shù)顯恒溫水浴鍋、滅菌鍋、紫外誘變箱、循環(huán)水多用真空泵。

1.1.3 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、磷酸二氫鉀2 g、檸檬酸二胺2 g、乙酸鈉5 g、葡萄糖20 g、七水硫酸鎂0.58 g、四水硫酸錳0.25 g、吐溫800 mL，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。1 mL X－α－Gal/L溶液(每800毫升添加50毫克指示劑)。

發(fā)酵培養(yǎng)基:初篩培養(yǎng)基中2%的葡萄糖用棉子糖取代。

1.2 分析方法

1.2.1 產(chǎn)α－半乳糖苷酶菌株的篩選

(1)初篩

在無菌條件下，用無菌雙蒸水對泡菜汁進行逐級梯度稀釋(10－1－10－7)，吸取 10－5、10－6及 10－7三個梯度各100 μL溶液分別涂布在初篩固體培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)3－4 d，使菌落變成藍色的菌落，挑取單菌落進行液體發(fā)酵。

(2)發(fā)酵

將初篩的菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，用對硝基酚法測定酶活，篩選出酶活力最大的菌株作為目標(biāo)菌株［5］。

(3)紫外線誘變

將制備好的菌懸液放置在紫外誘變箱中，利用15W紫外燈，照射距離25 cm，設(shè)置照射時間分別為0.5 min、1.0 min、1.5 min、2.0 min、2.5 min、3 min 6 個梯度處理。

(4)亞硝酸鈉誘變

將制備好的菌懸液用亞硝酸鈉及醋酸分別處理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min，加入 pH 8.6的Na2HPO4溶液終止反應(yīng)。以亞硝酸鈉處理6 min的菌株A為實驗菌種，在斜面上連續(xù)傳代5代。

1.2.2 對硝基酚法測α－半乳糖苷酶酶活力

利用對硝基酚法測α－半乳糖苷酶酶活力［6］。

1.2.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

(1)α－半乳糖苷酶的最適pH

將α－半乳糖苷酶液在pH4.5－pH7.5下進行酶促反應(yīng)以測定其最適pH值。以pNPG為底物，37℃下反應(yīng)15 min測定酶活［7］。

(2)α－半乳糖苷酶的最適溫度

將α－半乳糖苷酶液在35℃－65℃下進行酶促反應(yīng)以測定其最適溫度，以pNPG為底物，pH5.5反應(yīng)15 min測定酶活。

(3)熱穩(wěn)定性

以pNPG為底物，pH5.5，溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的條件下保溫1 h，測定保溫后的殘余酶活性［8］。

(4)金屬離子對α－半乳糖苷酶活力的影響

用濃度為0.01 mol/l的金屬離子Ca2+、K+、Fe3+、Cu2+、EDTA分別與酶液以1:1的比例進行混合，37℃保存1 h后，分別在最適條件下進行酶活的測定。以未處理的酶液的酶活為100%計。

1.2.4 α－半乳糖苷酶固定化

配制不同濃度(1%、2%、3%、4%、5%)的海藻酸鈉，各取5 mL放于不同的燒杯中，各加入5 mL菌懸液，混勻靜置30 min，用7號注射器吸取1 mL混合液逐滴滴入20 mL 2%的CaCl2溶液中，室溫固定0.5 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 高產(chǎn)α－半乳糖苷酶菌株的篩選

2.1.1 菌種的定向篩選

吸取10－5、10－6及10－7三個梯度稀釋的泡菜汁涂布于初篩固體培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)3－4 d后，菌落顯示藍色的有9株，進一步通過發(fā)酵培養(yǎng)后測定酶活。酶活力最強菌株酶活可達19.7 U/mL，本研究以此菌株作為出發(fā)菌株。此菌株在固體培養(yǎng)基上生長48 h后，形成乳白色圓形菌落，且表面光滑、邊緣整齊、無褶皺、呈短桿狀、直徑約1 mm、革蘭氏染色陽性。

2.1.2 紫外誘變選育

將制備好的菌懸液放置在紫外誘變箱中，誘變 0.5 min、1.0 min、1.5 min、2.0 min、2.5 min、3 min，紫外誘變對致死率的影響結(jié)果如表1所示。根據(jù)菌種誘變致死率與基因突變率的一般規(guī)律，致死率在80%時的正突變率較高，確定照射時間為2.0 min為最佳處理時間。將照射時間為2.0 min的菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵培養(yǎng)液測酶活，結(jié)果顯示酶活達28.6 U/mL，酶活提高45%。

表1 紫外線誘變處理結(jié)果

2.1.3 亞硝酸鈉誘變

將制備好的菌懸液用亞硝酸鈉與醋酸的混合液分別處理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min，加入pH 8.6的Na2HPO4溶液終止反應(yīng)。處理時間對致死率的影響結(jié)果如表2所示。根據(jù)菌種誘變致死率與基因突變的一般規(guī)律，致死率在80%時的正突變率較高，確定處理時間為6 min為最佳處理時間，酶活達36.9 U/mL酶活相比出發(fā)菌株提高87%。

表2 亞硝酸鈉誘變處理結(jié)果

2.1.4 傳代性能

傳代后測定酶活力結(jié)果如表3所示，經(jīng)多次傳代，該菌株產(chǎn)α－半乳糖苷酶活性沒有多大變化，均保持在95%左右。表明該突變菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，可作為工業(yè)化大生產(chǎn)的種子使用。

表3 傳代穩(wěn)定性

2.2 α－半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 α－半乳糖苷酶的最適pH和溫度

以pNPG為底物，反應(yīng)溫度37℃，pH為4.5－7.5，設(shè)pH間隔為0.5的不同pH緩沖液，反應(yīng)時間15 min，測定酶活。所測得的最高酶活為基準酶活100%，其余數(shù)據(jù)折算，以比較不同的pH緩沖液對相同酶液的酶活影響。結(jié)果如圖1所示，菌株液體發(fā)酵產(chǎn)生的α－半乳糖苷酶在pH5.5左右表現(xiàn)出較高的酶活力。說明該酶最適pH偏酸，適合應(yīng)用于酸性環(huán)境下的工業(yè)化生產(chǎn)。

圖1 pH對α－半乳糖苷酶活力的影響

以pNPG為底物，反應(yīng)pH5.5，35℃－65℃，設(shè)間隔溫度5℃，反應(yīng)時間15 min，測定酶活。所測得的最高酶活為基準酶活100%，其余數(shù)據(jù)折算，以比較不同的溫度對相同酶液的酶活影響。結(jié)果如圖2所示，酶活力隨溫度升高而增大，測得最適反應(yīng)溫度，超過此溫度，酶活力便急劇下降。菌株所產(chǎn)α－半乳糖苷酶的最適作用溫度為50℃，當(dāng)溫度超過50℃酶活力下降較快。

2.2.2 α－半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性

以pNPG為底物，pH5.5，溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的條件下保溫1 h，測定保溫后的殘余酶活性，結(jié)果如圖3所示。酶活力在30℃、40℃和50℃時都比較穩(wěn)定，保持為90%以上;在60℃時酶活力保留在35%左右，70℃時酶活僅保留了約5%;而80℃保溫1.0 h酶活就已降到0%，完全失活。說明α－半乳糖苷酶在50度以下比較穩(wěn)定，50℃以上酶活逐漸喪失，實際應(yīng)用中應(yīng)盡量將其存放在50℃以下環(huán)境，保證其最大酶活力的發(fā)揮。

圖2 溫度對α－半乳糖苷酶活力的影響

2.3 α－半乳糖苷酶的固定化初步探索

將1%－6%海藻酸鈉溶液與酶液按1∶1比例混合，吸入注射器內(nèi)，再逐滴滴入2%氯化鈣和卡拉膠混合溶液中，即成規(guī)則球形，0.5 h后，測定酶的活力。結(jié)果如圖4所示，海藻酸鈉固定化后，酶活有不同程度損失，海藻酸鈉濃度為4%時酶活力較高，可以保持在70%左右［9］。因此可用4%海藻酸鈉固定α－半乳糖苷酶。

圖3 α－半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性圖

圖4 海藻酸鈉濃度對固定化酶酶活的影響

3 結(jié) 論

本實驗以泡菜汁為原料篩選產(chǎn)α－半乳糖苷酶菌株，通過X－α－Gal平板顯色初篩，獲得9株產(chǎn)α－半乳糖苷酶的菌株。其中酶活力最強菌株酶活達19.7 U/mL。以該菌株為出發(fā)菌株，分別通過紫外線誘變和亞硝酸鈉誘變處理，使誘變菌株酶活達到36.9 U/mL。對高酶活菌株進行5次傳代培養(yǎng)，誘變后的菌株的高酶活性能未發(fā)生很大變化，表明其具有良好的遺傳穩(wěn)定型。接著研究了復(fù)篩得到的α－半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)，此酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH為5.5。初步探索該酶的固定化結(jié)果表明海藻酸鈉固定化α－半乳糖苷酶的最佳濃度條件為:以4%的海藻酸鈉與稀釋酶液1∶1(V∶V)混合時固定化酶的酶活較高。一種固定化酶能否應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，關(guān)鍵在于固定化方法要簡單易行、固定化后酶的活性要高、操作半衰期要長、固定化費用要低。本試驗用海藻酸鈉固定化α－半乳糖苷酶的方法雖然簡單易行、固定化費用較低、所得固定化酶的酶活較高，但機械強度較差。凝膠強度不夠而導(dǎo)致易破碎溶解且海藻酸鈣凝膠不耐熱，高溫下加速溶解，因此仍有待進一步研究。成品化的α－半乳糖苷酶有望于解決特殊人群對豆類食品的消化障礙，提高豆粕在飼料中的利用率，提高蔗糖的析出率，增加包埋藥物的穩(wěn)定性，延長藥效［10－13］。

［1］郝桂娟，張凱，王學(xué)智.α－半乳糖苷酶的研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2013，23(3):223－225.

［2］邊連全，白東偉，劉顯軍.α－半乳糖苷酶和木聚糖酶在斷奶仔豬日糧中的應(yīng)用效果評價［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2010，21(2):66－69.

［3］辛永平，孔文濤，陸文偉，等.K1α－半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)［J］.山東大學(xué)學(xué)報:理學(xué)版，2015，50(1):50－55.

［4］朱振元，劉曉翠，郭蓉，等.蛹蟲草多糖對α－葡萄糖苷酶活性的抑制研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2014，30(12):55－60.

［5］許堯興，許少春，姚曉紅，等.α－半乳糖苷酶產(chǎn)酶菌種的定向篩選及誘變選育［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，18(5):362－264.

［6］許堯興，李艷麗.黑曲霉變種α－半乳糖苷酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.浙江大學(xué)學(xué)報:農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2009，352:147－152.

［7］崔愛萍，遲乃玉，張慶芳.海洋低溫β－半乳糖苷酶菌株篩選、鑒定及酶的分離純化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè).2013，39(2):92－96.

［8］董巖巖，張燕婕，黃遵錫.產(chǎn)α－半乳糖苷酶菌株的篩選、鑒定及其酶學(xué)特性的研究［J］.飼料工業(yè)，2011，32(14):22－25.

［9］喬楠，郭威，于大禹.固定化基因工程菌應(yīng)用于水環(huán)境污染治理的研究進展［J］.東北電力大學(xué)學(xué)報，2010，30(2):18－21.

［10］Patil A，Praveen K，Mulimani V，et al.alpha－galactosidase from bacillus megaterium VHM1 and its application in removal of flatulence－causing factors from soymilk［J］.Microbiol Biotechnol.2010，20(5):1546－1554.

［11］Yafeng Z，Gang S，Xiao－Tong Z，et al.Identification of an intestine－specific promoter and inducible expression of bacterial alpha－galactosidase in mammalian cells by a lac operon system［J］.J Anim Sci Biotechnol，2012，3(1)32:245－248.

［12］張?zhí)m河，韓猛，鄭梅花，等.Cu2+對SBR運行效果的影響［J］.東北電力大學(xué)學(xué)報，2014，34(6):30－33.

［13］楊日光，張?zhí)m河，劉強，等.廢水生物處理工藝短程硝化影響因素探討［J］.東北電力大學(xué)學(xué)報，2012，32(1):62－64.