?

貴州省部分地區(qū)陰道毛滴蟲與人型支原體共生情況*

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-03-19網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.1021.028.html

匡貴榕1, 衣鳳蕓2, 楊宇箭1, 程其會(huì)1, 王麗娟1, 吳家紅3**

(1.安順市人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 貴州 安順561000； 2.《中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志》編輯部， 上海200025； 3.貴陽醫(yī)學(xué)院 寄生蟲學(xué)教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 了解貴州地區(qū)陰道毛滴蟲臨床分離株與人型支原體共生情況。方法： 以貴州部分地區(qū)女性陰道毛滴蟲病患者陰道后穹隆分泌物中采集的陰道毛滴蟲蟲株，實(shí)驗(yàn)室達(dá)到純培養(yǎng)后，采用Chelex-100的方法提取滴蟲基因組DNA，設(shè)計(jì)人型支原體16S rDNA特異引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，觀察滴蟲細(xì)胞內(nèi)人型支原體共生情況。結(jié)果： 從臨床共采集到165株蟲株中，83株獲得純培養(yǎng)；83株中人型支原體檢測結(jié)果顯示有47株陽性，陽性率為56.6%。結(jié)論： 陰道毛滴蟲蟲株與人型支原體共生情況在我國貴州地區(qū)普遍性存在。

[關(guān)鍵詞]毛滴蟲,陰道； 支原體人型； 16S rDNA； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 共生

陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)是寄生在人體泌尿生殖系統(tǒng)的原蟲，能引起的陰道毛滴蟲??；這是世界范圍內(nèi)流行的非病毒性性傳播疾病，是引起女性陰道炎的一個(gè)重要原因，全球每年約有1.7億人被感染。人型支原體(Mycoplasmahominis)是一種常見的寄生于人體泌尿道和生殖道的病原體，既往曾認(rèn)為它是對(duì)人類無害的共棲微生物，近年來卻發(fā)現(xiàn)，人型支原體感染不僅可致陰道炎、宮頸炎等下生殖道的炎癥，還可致子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎以及盆腔炎等疾病。國外的研究顯示人型支原體能夠進(jìn)入毛滴蟲細(xì)胞內(nèi)長期存活并進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，形成穩(wěn)定的共生關(guān)系，這種共生可保護(hù)人型支原體免受宿主防御機(jī)制和藥物治療等外環(huán)境的影響。2009年1月~2012年9月采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)對(duì)貴州部分地區(qū)的陰道毛滴蟲臨床分離株內(nèi)的人型支原體進(jìn)行檢測，初步了解貴州部分地區(qū)陰道毛滴蟲與人型支原體的共生情況。

1材料與方法

1.1　陰道毛滴蟲的來源及培養(yǎng)

陰道毛滴蟲采自貴陽市婦產(chǎn)醫(yī)院、 安順市地區(qū)人民醫(yī)院和安順市計(jì)生站女性陰道毛滴蟲病患者。于無菌條件下，使用消毒棉簽取患者陰道后穹窿分泌物置入含抗生素(終濃度：青霉素 200 U/mL,鏈霉素 200 U/mL)及10%小牛血清的肝浸湯培養(yǎng)基中，保溫條件下迅速送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。 37 ℃培養(yǎng)24 h后，吸取培養(yǎng)管近底部液體10～20 μL，在顯微鏡下觀察是否有滴蟲生長，如為陰性，繼續(xù)培養(yǎng)3代，如果仍為陰性，滅菌后丟棄；如為陽性，48 h后傳代，共傳代 3次。取1 mL毛滴蟲的混懸液接種到Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，若未出現(xiàn)渾濁，且取樣鏡檢未見污染，即證明該樣品已達(dá)到純培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2　主要試劑和儀器

蛋白胨、L—半胱氨酸鹽酸鹽和酵母浸出液均購自美國Amresco公司。dNTPs和TaqDNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司，瓊脂糖購自美國Promega公司，Chelex-100購自美國BIO-RAD公司，其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。電泳儀(DYY2C)為北京六一儀器廠產(chǎn)品，凝膠成像分析系統(tǒng)為美國GE公司產(chǎn)品。

1.3　方法

1.3.1DNA提取[4-5]采用chelex-100的方法，將純化的滴蟲培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)滴蟲，滴蟲濃度達(dá)到1×107/mL時(shí)，將培養(yǎng)液12 000 r/min離心5 min后收集滴蟲蟲體到1.5 mL EP管中，加入200 μL 5% Chelex-100 和10 μL的20 g/L蛋白酶K，振蕩混勻，55 ℃孵育45 min，沸水浴中8～10 min，冰浴2 min，室溫下12 000 r/min離心3 min，上清即為DNA，將提取的DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測濃度和純度后，-20 ℃保存。

1.3.2 人型支原體的16S rRNA基因參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增人型支原體的16S rRNA基因序列的特異性引物，上游引物為5′-CAATGGCTAATGCCGGATACGC-3′，下游引物為5′-GGTACCGTCAGTCCGCAAT-3′。片段大小為334 bp，反應(yīng)體系為模板DNA 50 ng ，10×PCRbuffer 2.5 μL，MgCl2(2.5 mmol/L) 3 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL，TaqDNA聚合酶1.25 U，上、下游引物(25 μmol/L)各1 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s、35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，并在成像系統(tǒng)中成像。

2結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)共采集到165株陰道毛滴蟲臨床分離株，達(dá)到純培養(yǎng)并用于本研究的有83株，達(dá)到純培養(yǎng)的滴蟲見圖1。對(duì)達(dá)到純培養(yǎng)的83株蟲株進(jìn)行人型支原體PCR檢測，結(jié)果顯示共有47株分離株在約為330 bp處擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物(圖2)，說明這47株分離株為人型支原體陽性，陽性率為56.6%(47/83)。

圖1　光鏡下陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體(40×)Fig.1　Trophozoite of Trichomonas vaginalis

3討論

M為100 bp DNA標(biāo)志物，1-23為23個(gè)分離株的編號(hào)，C為陰性對(duì)照?qǐng)D2　PCR檢測陰道毛滴蟲臨床分離株內(nèi)人型支原體Fig.2　Detection of M. hominis in clinical strains of T.vaginalis by PCR

1975年, Nielsen通過電子顯微鏡觀察到陰道分泌物和體外培養(yǎng)6周的陰道毛滴蟲大食物泡內(nèi)有支原體存在，從形態(tài)學(xué)上第1次發(fā)現(xiàn)陰道毛滴蟲與人型支原體的共生關(guān)系。 Rappelli等體外感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有人型支原體能感染無支原體感染的陰道毛滴蟲，而作為泌尿生殖道感染的主要病原體解脲支原體和生殖支原體并不能感染。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)感染有人型支原體的陰道毛滴蟲可以將支原體傳播給陰道上皮細(xì)胞，且陰道上皮細(xì)胞中的人型支原體也可感染陰道毛滴蟲。從而證實(shí)了這兩種營寄生生活的病原體之間存在共生關(guān)系。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,從臨床分離到的35株陰道毛滴蟲中有33株內(nèi)有人型支原體，陽性率為94.3%。表明這兩種生物的共生是一種普遍現(xiàn)象。本研究對(duì)從貴州省部分地區(qū)分離到的83株陰道毛滴蟲蟲株人型支原體感染調(diào)查顯示有47株檢測陽性，陽性率為56.6%，這一結(jié)果和Xiao等報(bào)道的從中國廣州地區(qū)分離到的28株陰道毛滴蟲檢測到14株人型支原體陽性蟲株，陽性率50%的結(jié)果比較接近，但低于劉曉東等[10]在鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院從30個(gè)陰道毛滴蟲蟲株中檢出25株人型支原體陽性(83.33%)，河南地區(qū)41株陰道毛滴蟲蟲株中檢測出34株陽性的結(jié)果(82.9%)[11]，但卻高于四川地區(qū)160株檢出61株陽性(38.1%)[12]和謝成彬等[13]在四川省婦幼保健院婦科門診檢測38.0%(76/200)的結(jié)果。說明人型支原體與陰道毛滴蟲的共生具有地域的差別。此外，最新的研究顯示人型支原體的共生可上調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，表明人型支原體的共生可加重陰道毛滴蟲對(duì)宿主的損害[14]。這就提醒臨床醫(yī)生在發(fā)現(xiàn)陰道毛滴蟲后有必要進(jìn)一步做支原體的檢測，同時(shí)在治療上也最好聯(lián)合用藥，以提高滴蟲性陰道炎的治療效果。當(dāng)前，關(guān)于兩者的共生與陰道毛滴蟲產(chǎn)生抗藥性是否有關(guān)的研究還很少，如能進(jìn)一步從生理、藥理和遺傳等多方面了解這兩種病原體的關(guān)系及其對(duì)人體的影響，則意義顯得更為重要。

參考文獻(xiàn)4

[1]World Health Organization. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections: overview and estimates. Geneva，Switzerland：WHO， 2001：27-29.

[2]Vancini RG，Pereira-Neves A，Borojevic R，et al．TrichomonasvaginalisharboringMycoplasmahominisincreases cytopathogenicity in vitro[J]． Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2008(4)：259-267．

[3]Dessi D，Delogu G，Emonte E，et al. Long-term survival and intracellular replication ofMycoplasmahominisinTrichomonasvaginaliscells：potential role of the protozoon in transmitting bacterial infection[J]. Infect Immun， 2005(2)：1180-1186.

[4]朱曉燕，王雅靜，畢世樑，等. 四川地區(qū)陰道毛滴蟲內(nèi)人型支原體的PCR檢測[J].四川動(dòng)物， 2009(6):874-876.

[5]Mayta H，Gilman RH，Calderon MM，et al. 18S ribosomal DNA-based PCR for diagnosis ofTrichonomasvaginalis[J]. J Clin Microbiol， 2000(7):2683-2687.

[6]van der schee C，Sluiters HJ，van der Meijden WI，et al. Host and pathogen interaction during vaginal infection byTrichonomasvaginalisandMycoplasmahominisor Ureaplasma urealyticum[J]. J Microbiol Methods， 2001(1):61-67.

[7]Nielsen MH. The ultrastructure ofTrichomonasvaginalisDonné before and after transfer from vaginal secretions to Diamond's medium.Acta Path Microbiol Scand, 1975(6):581-589

[8]Rappelli P，Addis MF，Carta F，et al.Mycoplasmahominisparasitism ofTrichomonasvaginalis[J]. Lancet， 1998(9136):1286.

[9]Xiao JC，Xie LF，F(xiàn)ang SL，et al. Symbiosis ofMycoplasmahominisinTrichomonasvaginalismay link metronidazole resistance in vitro[J]. Parasitol Res， 2006(1):123-130.

[10]劉曉東，溫雯靜，薛長貴. 陰道毛滴蟲與人型支原體共生對(duì)鐵氧還蛋白基因影響[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志， 2011(4):800-803.

[11]楊森，劉素英，王黎，等. 陰道毛滴蟲與人型支原體共生對(duì)AP33基因序列的影響[J]. 中國病原生物學(xué)雜志， 2013(11):979-981，996.

[12]王頻佳，謝成彬. 人型支原體共生與陰道毛滴蟲甲硝唑耐藥性的關(guān)系[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志， 2012(3):210-213.

[13]謝成彬，王頻佳，吳雨露，等. 人型支原體共生對(duì)甲硝唑臨床治療陰道毛滴蟲感染的影響[J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展， 2013(6):461-464.

[14]Fiori PL, Diaz N, Cocco AR, et al. Association ofTrichomonasvaginaliswith its symbiontMycoplasmahominissynergistically upregulates the in vitro proinflammatory response of human monocytes. Sex Transm Infect, 2013(6):449-54.

(2014-12-28收稿，2015-02-20修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯：劉華

Investigation on Symbiosis ofMycoplasmahominisinTrichomonas

vaginalisin Some Areas of Guizhou Province

KUANG Guirong1, YI Fengyun2, YANG Yujian1, CHENG Qihui1, WANG Lijuan1, WU Jiahong3

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,AnshunCitypeople'sHospital,Anshun561000,Guizhou,China;

2.EditorialDepartment,ChineseJournalofParasitologyandParasiticDiseases,Shanghai200025,China;

3.DepartmentofParasitology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the symbiosis of Mycoplasma hominis in Trichomonas vaginalis in Guizhou Province. Methods: The clinical strains of T. vaginalis were collected from the hospitals and family planning service stations in Guiyang city and Anshun city. After pure culture in lab, the genome DNA of T. vaginalis was extracted by Chelex-100, and 16S rDNA fragment of M. hominis was amplified by PCR with the specific primers. Agarose gel electrophoresis analysis was conducted and the symbiosis of M.hominis in T.vaginalis was observed. Results: A total of 165 strains were collected from the hospitals and family planning service stations, and 83 clinical strains attained pure culture, of which 47 strains were detected positively for M. hominis. The positive rate was 56.6%. Conclusions: The symbiosis of M.hominis in T.vaginalis is prevalent in Guizhou province.

[Key words]Trichomonas vaginalis; Mycoplasma hominis; 16S rDNA; polymerase chain reaction; symbiosis

[中圖分類號(hào)]R382.211

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2015)03-0249-04

通信作者**E-mail:657490050@qq.com

[基金項(xiàng)目]*貴州省省長 [黔科教辦(2005)14號(hào)]；安市科合[20]36號(hào)；貴陽醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金