霍玲玲，馮健科

1天水市中西醫(yī)結合醫(yī)院，甘肅 天水 741020；2天水市第五人民醫(yī)院

消腫止痛洗劑為天水市中西醫(yī)結合醫(yī)院多年應用臨床驗方，全方由地榆炭、赤芍、蒼術、草烏、紫草、當歸、天花粉、乳香、地榆10味中藥組成，具有清熱止痛，消腫生肌的功效。其臨床療效確切［1-6］，但尚未建立其微生物限度檢查方法。本文參照《中國藥典》［7］規(guī)定，對消腫止痛洗液的微生物限度檢查法進行了的驗證，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 儀器 YM75FN型生物安全柜(上海島韓實業(yè)有限公司)，LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海島韓實業(yè)有限公司)，MJX-50霉菌培養(yǎng)箱(上海島韓實業(yè)有限公司)。

1.2 培養(yǎng)基和稀釋液 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術公司，101129)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術公司，1012152)，pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(北京陸橋技術公司，100316)，膽鹽乳糖增菌液(北京陸橋技術公司BL增菌液，090310)改良馬丁培養(yǎng)基（青島海博生物，100301）營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（青島海博生物，090301）。

1.3 試驗樣品 消腫止痛洗液(天水市中西醫(yī)結合醫(yī)院制劑室自制，100 mL/瓶)。

1.4 菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26003］、大腸埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44102］、白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(F)98001］、黑曲霉菌(Aspergi l lus niger)［CMCC(F)98003］均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.5 方法

1.5.1 菌液的制備 分別取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24小時的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌肉湯培養(yǎng)物1mL，加9mL鹽水10倍稀釋至10-5～10-7為50～100 cfu/mL，接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)24～48小時，取培養(yǎng)液1mL加入0.9%無菌氯化鈉溶液9mL中，10倍依次稀釋至加9 mL鹽水10倍稀釋至10-5～10-7為50～100 cfumL，取經(jīng)25.5℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5mL鹽水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，用標準比濁管比濁，與濁度相當后，取1mL霉菌孢子液加9 mL鹽水稀釋，逐管10倍稀釋為10～4約 50～100 cfu/mL，做活菌計數(shù)備用。

1.5.2 供試品制備 稱取樣品10mL，加0.9%無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，制成1∶10均勻的供試液。

1.5.3 細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)法回收率的測定及方法驗證 試驗組取供試液1mL和上述試驗菌懸液1mL，分別注入無菌平皿中，立即傾注相應的瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，立即振搖，待凝固后倒置于培養(yǎng)箱，分別培養(yǎng)，計數(shù)。菌液組取上述如2.1測定所加的試驗菌數(shù)。供試品對照組取1mL1∶10供試液注入平皿，立即傾入相應培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后按規(guī)定條件培養(yǎng)，每日觀察，計算菌落數(shù)，測定其供試品本底菌數(shù)。回收率=(試驗組菌落數(shù)-供試品組菌落總數(shù))×100%/菌液組菌落數(shù)

1.5.4 控制菌檢查方法的驗證 試驗組取1∶10供試液10mL，分別加入100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，再分別加入1mL 50～100 cfu/mL的金黃色葡萄球菌菌液和銅綠假單胞菌菌液，依《中國藥典》相應控制菌檢查法進行檢查。陰性菌對照組取供試液10mL及金黃色葡萄球菌菌懸液1mL，與試驗組同法試驗。供試品組取供試液10mL，與試驗組同法試驗。

2 結果

2.1 回收率 各菌種的回收率均高于70%。見表1—2。

表1 常規(guī)法測定細菌試驗驗證結果 cfu/mL

表2 常規(guī)法測定霉菌、酵母菌試驗驗證結果cfu/mL

2.2 控制菌檢查方法再驗證結果 在3次獨立的平行試驗中陰性菌對照組無菌生長，陽性對照組檢出相應的控制菌，試驗組未檢出試驗菌。

3 討論

《中國藥典》（2010年版）規(guī)定當建立藥品的微生物限度檢查法時，需進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法和控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用方法適合于該藥品的檢查［8］。驗證試驗結果表明消腫止痛洗液無抑菌作用，可依據(jù)《中國藥典》2010年版按常規(guī)方法進行微生物限度檢查。本研究所建立的“消腫止痛洗液微生物限度檢查方法”經(jīng)方法學驗證，細菌、霉菌及酵母菌檢查采用常規(guī)法平皿計數(shù)方法，試驗方法成立；控制菌檢查經(jīng)方法學驗證，采用常規(guī)法，試驗方法成立。

［1］ 李盛華.消腫止痛合劑治療下肢創(chuàng)傷早期腫痛146例總結［J］.甘肅中醫(yī)，2000，13(1)：34-35.

［2］ 張遠，屈彩琴，郭俊華.水蛙活血化疲的實驗研究［J］.天津中醫(yī)，1998，4(2)：88-89.

［3］ 陳志龍，鄧強，張彥軍.消腫止痛合劑預防骨折術后下肢深靜脈血栓形成的臨床觀察［J］.甘肅中醫(yī)，2009，22(12)：28-30.

［4］ 柳海平，李玉吉，王承祥，等.消腫止痛合劑預防全髓關節(jié)置換術后異位骨化的臨床研究［J］.中國骨傷，20l1，25(l0)：857-860.

［5］ 柳海平，王承祥，李玉吉，等.消腫止痛合劑預防全髓關節(jié)置換術后異位骨化的臨床分析［J］.西部中醫(yī)藥，2011，24(8)：83-85.

［6］ 柳海平，王承祥，柴喜平，等.氨酚輕考酮片配合消腫止痛合劑對全膝關節(jié)置換術后鎮(zhèn)痛效果的臨床觀察［J］.西部中醫(yī)藥，2011，24(l0)：4-6.

［7］ 中華人民共和國藥典委員會.中國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄107-116.