趙生華

隴西縣中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科，甘肅 隴西 748100

宮頸癌(cervical carcinoma)是發(fā)病率僅次于乳腺癌的常見(jiàn)婦女惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年約有近10萬(wàn)新發(fā)病例，且每年約有3萬(wàn)婦女死于宮頸癌［1］，嚴(yán)重威脅婦女的身體健康。目前宮頸癌的主要治療方法為外科手術(shù)和以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療，化療是晚期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的姑息治療手段及手術(shù)或放療的輔助治療手段，但化療藥物具有嚴(yán)重的惡心、嘔吐及腎功能損害等毒副作用，使如何減少化療藥物的用量及毒副作用成為廣大腫瘤研究者的奮斗目標(biāo)，近年來(lái)中藥以其抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫、使用安全無(wú)明顯毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，已成為抗腫瘤治療的研究熱點(diǎn)?？鄥A(Matrine)是從中藥苦參中提取的一種生物活性成分，具有抗氧化、抗心率失常，抗炎，抗病毒，調(diào)節(jié)免疫，保肝等作用［2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，沒(méi)有化療藥物的毒副作用，在胃癌、肝癌、肺癌、白血病中研究較多［3-5］，但對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞的研究尚少，本實(shí)驗(yàn)旨在探討Mat對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞的增殖、凋亡的影響及其可能的分子機(jī)制，為Mat應(yīng)用于宮頸癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，探討其在婦科惡性腫瘤治療中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 宮頸癌Siha細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。用含10%胎牛血清和1OOU/mL青霉素、100 pg/mL鏈霉素、2%谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下半貼壁細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 苦參堿注射液(純度＞98.0%，西安天園生物制劑廠)，RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司，批號(hào)：121207)，Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：120416)，Survivin抗體(美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：111228-2)，RPMI-1640培養(yǎng)液（上海元龍生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：120523）、小牛血清(美國(guó)Gibco公司,批號(hào)：130112)，MTT(美國(guó) Sigma公司,批號(hào)：100819)、二甲基亞砜(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：100911)、瓊脂糖(美國(guó) Sigma公司，批號(hào)：101011)，TRIzol試劑(美國(guó)Invit rogen生命技術(shù)公司,批號(hào)：110924)，TaqDNA聚合酶(美國(guó)Promage公司，批號(hào)：120102)，Ol igod(美國(guó)Promage公司，批號(hào)：110419)，RNAsin(美國(guó) Promage公司，批號(hào)：120812)，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 主要儀器和設(shè)備 8000 DH直熱型NAPCO CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)，IX-70型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，F(xiàn)ACSIO1型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BectonDickinson公司)，Powerwave X酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-TEK公司)，MJ PTC-220 PCR儀(美國(guó)M.J.Research公司)，Rotor Gene 3000型實(shí)時(shí)定量PCR儀(澳大利亞Corbet t Research公司)。

1.4 方法

1.4.1 SRB(sul forhodamine B，磺基羅丹明B)法檢測(cè) 苦參堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖抑制影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Siha細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化吹打，制成1×105/mL單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，培養(yǎng)24小時(shí)。將Siha細(xì)胞分為Mat組及對(duì)照組分別加藥。Mat組的終濃度依次為：0.25、0.5、1.0，2.0mg/mL。以不加藥組為對(duì)照組(細(xì)胞懸液100μL、培養(yǎng)液100μL)，另設(shè)調(diào)零孔(只加培養(yǎng)液200μL)，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng) 24小時(shí)和72小時(shí)，每孔加10%(w/v)三氯醋酸4℃固定1小時(shí)后用蒸館水洗4～5次，瞭干后，每孔加0.4%(w/v)SRB 100mI在室溫染色20分鐘，然后用1%醋酸輕洗5次除去非特異性結(jié)合的染料，甩干，每孔加10mmol/LTris-base溶液(pHlO.5)150μL溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定510 nm處吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)吸光度(OD值)。細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組OD值-藥物組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.4.2 Annexin V FITC/PI 雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Siha細(xì)胞制成1×105/mL細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。加入苦參堿使其終濃度分別為 0、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL，培養(yǎng)至 48小時(shí)后，用0.25%胰蛋白酶消化，收集1×106/mL細(xì)胞1mL，1 000rpm4℃離心10分鐘棄上清，加入5mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再重復(fù)離心，棄上清，加入200μLAnnexin-V緩沖液重懸，再加入10μLAnnexin V-FITC和5μLPI，室溫避光孵育20分鐘，加入400μLAnnexin-V緩沖液，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率并分析細(xì)胞周期。重復(fù)3次。

1.4.3 倒置相差顯微鏡檢測(cè) 將Siha細(xì)胞以3×l04個(gè)/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后，加入終濃度為 0、0.25、0.5、1.0和 2.0 mg/mL的苦參堿。作用24小時(shí)后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并照相。

1.4.4 MDC染色檢測(cè)自噬 將Siha細(xì)胞接種于預(yù)先放置載玻片的6孔培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞在載玻片上貼壁后加入終濃度為1mg/mL的苦參堿。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，棄培養(yǎng)液，用0.05 mMMDC在37℃蜉育10分鐘染色標(biāo)記自噬泡。然后用PBS漂洗細(xì)胞3次，立即用熒光顯微鏡檢測(cè)并照相。

1.4.5 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)促凋亡基因Bax和自噬相關(guān)基因Becl in 1的mRNA表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 Siha細(xì)胞，加入苦參堿使其終質(zhì)量濃度分別為 0、0.25、0.5、1.0和 2.0 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，用Trizol試劑提取細(xì)胞總 RNA，電泳檢測(cè)RNA，用TaKaRa公司的PrimescriptTM RT reagent kit試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用SYBR Green I熒光染色法和Rotor Gene 3000 real-time PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。引物由大連寶生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為：Bax 5′-TGCTTCAGGGTTTCATCCAG-3′(上游引物)，5′-GGCGGCAATCATCCTCTG-3′(下游引物)，Becl in1 5′-GAGGGATGGAAGGGTCTAAG-3′(上游引物)，5′-GCCTGGGCTGTGGTAAGT-3′(下游引物)，p-actin 5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′(上 游 引 物 )，5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′(下游引物)，β-action為內(nèi)參照基因，反應(yīng)條件為：首先95℃預(yù)變性2分鐘，然后95℃變性10秒，60℃退火/延伸 20秒，共45個(gè)循環(huán)。并用2%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)證實(shí)PCR產(chǎn)物的片段大小為目的基因產(chǎn)物。通過(guò)Rotor-Gene Real-Time Analysis Sof tware 6.1.81軟件來(lái)計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用(χ±s)表示，用 t檢驗(yàn)，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)Siha細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度Mat作用于Siha細(xì)胞24和72小時(shí)后，均不同程度抑制其生長(zhǎng)，并且隨著Mat濃度增加及培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用也在增強(qiáng)，呈現(xiàn)時(shí)間－劑量依賴性；各劑量組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 苦參堿對(duì)Siha細(xì)胞周期和凋亡的影響 不同濃度苦苦參堿作用于Siha細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，G0-G1期逐漸增加，S期、G2-M期細(xì)胞比例逐漸降低，表明苦參堿將Siha細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的G0-G1期，見(jiàn)圖1。并且隨著劑量的增加，Siha細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 苦參堿對(duì)Siha細(xì)胞周期分布的影響

表2 不同濃度Mat誘導(dǎo)宮頸癌Siha細(xì)胞的凋亡率

2.3 倒置相差顯微鏡顯示細(xì)胞質(zhì)中有空泡形成 不同濃度苦參堿干預(yù)24小時(shí)后，用倒置相差顯微鏡可觀察到在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量大小不等的空泡，隨著苦參堿濃度的增加，細(xì)胞質(zhì)中空泡逐漸增大增多，細(xì)胞不能貼壁而懸浮在培養(yǎng)液中。(見(jiàn)圖2—3)。

圖2 、3 參堿干預(yù)后宮頸癌Siha細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

2.4 MDC染色熒光顯微鏡檢測(cè) 可見(jiàn)苦參堿組比未處理組顯示更強(qiáng)的熒光信號(hào)和更多的MDC標(biāo)記顆粒，MDC能夠被細(xì)胞吸收并顯示于自噬泡上，此時(shí)用熒光顯微鏡觀察時(shí)，在胞質(zhì)或核周區(qū)域可見(jiàn)到清晰的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，因此可根據(jù)熒光顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)顆粒的變化來(lái)判斷細(xì)胞內(nèi)自噬水平。苦參堿組比對(duì)照組顯示更強(qiáng)的熒光信號(hào)和更多的MDC標(biāo)記顆粒，表明苦參堿能誘導(dǎo)自噬泡的形成，見(jiàn)圖4。

圖4 MDC染色熒光顯微鏡檢測(cè)參堿干預(yù)后自噬泡

2.5 苦參堿上調(diào)Siha細(xì)胞Bax和Becl in 1 mRNA表達(dá) 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在苦參堿抗腫瘤過(guò)程中，自噬和調(diào)亡均被激活，而B(niǎo)ecl in1是第一個(gè)被確認(rèn)的哺乳動(dòng)物自噬基因，在自噬形成過(guò)程中與Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositide 3-kinase，PI3K)形成復(fù)合體招募泛素樣結(jié)合系統(tǒng)結(jié)合到隔離膜，促進(jìn)自噬的發(fā)生，因此是自噬形成的早期階段所必需的。而在細(xì)胞調(diào)亡過(guò)程中，p53上調(diào)Bax基因表達(dá)，Bax在線粒體上形成通道，使線粒體中的細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)，最終激活天冬氨酸特異性半脫氨酸蛋白酶-3(cysteine-containing aspartate-speci f ic protease，caspase-3)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此我們進(jìn)一步檢測(cè)自噬和調(diào)亡發(fā)生過(guò)程中的兩個(gè)關(guān)鍵分子的mRNA表達(dá)水平是否在苦參堿干預(yù)后升高。如圖5所示，實(shí)時(shí)突光定量RT-PCR結(jié)果表明苦參堿以劑量依賴方式上調(diào)Bax和Beclin 1 mRNA的表達(dá)水平。

圖5 苦參堿上調(diào)Siha細(xì)胞Bax和Becl in 1 mRNA表達(dá)水平，*P<0.01，**P<0.001。

3 討論

人們?cè)缫寻l(fā)現(xiàn)從中草藥及天然植物中提取的活性成分具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，如臨床上常用的抗癌藥物如長(zhǎng)春新堿、紫杉醇等最早都是從天然中草藥中提取成分，跟蹤分離篩選、結(jié)構(gòu)改造與化學(xué)合成的。因此，尋找高效、低毒的新型抗腫瘤藥物勢(shì)在必行，苦參堿是從豆科槐屬植物中提取的一種生物堿，為白金雀兒堿的異構(gòu)體，屬于四環(huán)的喹諾里西淀類，主要來(lái)源于苦參、山豆根和苦豆子等，廣泛分布于我國(guó)西北地區(qū)［6］。苦參堿于1958年首次成功分離，作為一種生物堿類活性成分，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且毒副作用較小。研究證明Mat有減輕放化、療毒副作用、升高白細(xì)胞、提高機(jī)體免疫力，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，增加化療藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性［7-8］。

本實(shí)驗(yàn)采用SRB法觀察苦參堿作用Siha細(xì)胞24、48、72小時(shí)后的抑制率，結(jié)果表明，苦參堿能明顯抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，隨著苦參堿濃度的增高，抑制作用也在增強(qiáng)，呈時(shí)間劑量依賴性，鏡下觀察細(xì)胞發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組Siha細(xì)胞由原來(lái)的多邊形，貼壁、形態(tài)飽滿，連接成片變成體積縮小、變圓，脫落懸浮于培養(yǎng)液中，胞質(zhì)、胞核顏色加深。另外其細(xì)胞周期分布也明顯改變，停滯于G0-G1期的細(xì)胞比例明顯增加，而進(jìn)入G2-M期和S期的細(xì)胞比例明顯下降，并且這種阻滯效應(yīng)具有一定的劑量依賴性。提示苦參堿對(duì)Siha細(xì)胞的增殖抑制作用可能是通過(guò)改變細(xì)胞周期的分布，使多數(shù)細(xì)胞停滯于細(xì)胞分化期即G1期，阻止細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化，減少了DNA合成和阻止細(xì)胞有絲分裂，抑制細(xì)胞增殖。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞程序性死亡，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡化不僅與細(xì)胞的增殖分化異常有關(guān)，還與其凋亡障礙有關(guān)［9］。文獻(xiàn)報(bào)道苦參堿亦能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞、膽囊癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞凋亡［10-11］。本研究采用Annexin-V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，苦參堿以劑量依賴方式誘導(dǎo)Siha細(xì)胞調(diào)亡，用 0.5、1.0、2.0mg/mL的苦參堿處理 Siha細(xì)胞后，調(diào)亡率分別為 (0.20±0.13)%、(72.92±3.41)%、(77.75±2.19)%和 (83.28±2.75)%。Siha細(xì)胞凋亡率隨著苦參堿劑量的增加而明顯升高，而對(duì)照組細(xì)胞只發(fā)生了自然凋亡。

當(dāng)藥物導(dǎo)致細(xì)胞DNA嚴(yán)重?fù)p傷難以修復(fù)時(shí)，p53啟動(dòng)細(xì)胞調(diào)亡程序。p53上調(diào)Bax基因表達(dá)，Bax蛋白在線粒體上形成通道，使線粒體中的細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)，最終激活caspase-3而導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡。本實(shí)驗(yàn)的實(shí)時(shí)突光定量RT-PCR結(jié)果顯示苦參堿能夠上調(diào)促凋亡基因Bax的mRNA表達(dá)水平，呈時(shí)間劑量依賴性。該結(jié)果和別的研究結(jié)果一致，Luo等［12］報(bào)道苦參堿通過(guò)上調(diào)促調(diào)亡分子Bak、Bax和Bim的表達(dá)水平而誘導(dǎo)胃癌MKN45細(xì)胞調(diào)亡。

我們用倒置相差顯微鏡觀察到苦參堿處理后在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的、大小不等的空泡，并且隨著苦參堿濃度的增加，細(xì)胞質(zhì)中空泡逐漸增大增多。突光顯微鏡觀察MDC染色標(biāo)記自噬泡的結(jié)果也支持苦參堿誘導(dǎo)自噬。

大量研究表明自噬和腫瘤存在相關(guān)性，而且自噬具有抑制腫瘤的作用。Becl in 1是酵母ATG6/Vps30基因的哺乳動(dòng)物同源基因，位于人類染色體17q21，是哺乳動(dòng)物第一個(gè)被確認(rèn)參與自噬過(guò)程的基因［13］。Aita等［14］報(bào)道在卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌中，Beclin 1單等位基因缺失分別達(dá)到75%、50%和40%。小鼠Becl in 1基因的雜合突變導(dǎo)致細(xì)胞增殖水平增強(qiáng)和自噬水平降低，并且Becl in 1突變小鼠的腫瘤發(fā)生率升高，如淋巴瘤、肺癌和肝癌［15］。Becl in 1蛋白和/或mRNA的表達(dá)水平在很多腫瘤細(xì)胞或癌組織常常降低或缺乏，如乳腺癌、卵巢癌、腦部腫瘤、宮頸癌和胃癌［16］。Karantza-Wadswor th等研究了Beclin 1等位基因缺失促進(jìn)乳腺腫瘤形成的機(jī)理，結(jié)果表明自噬功能不全會(huì)增加DNA損傷和基因組不穩(wěn)定性并最終導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生［17］。這些研究結(jié)果表明自噬在抑制腫瘤的發(fā)生中具有重要作用。

Becl in 1在自噬中是作為Ⅲ型PI3K復(fù)合體的一部分發(fā)揮作用，而Ⅲ型PI3K復(fù)合體是自噬形成的早期階段所必需的［18］。在本研究中，我們觀察到苦參堿上調(diào)Becl in 1的mRNA表達(dá)水平，呈時(shí)間劑量依賴性，表明苦參堿通過(guò)上調(diào)自噬相關(guān)基因Becl in 1的表達(dá)而誘導(dǎo)Siha細(xì)胞自噬。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)苦參堿對(duì)宮頸癌抗腫瘤機(jī)制研究的探討，使得我們利用凋亡、自噬機(jī)制治療腫瘤成為可能，從中尋找治療腫瘤靶點(diǎn)。

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