張麗姣,曾 艷,張 穎,宋 詼,賈士儒,孫媛霞,*

(1.天津科技大學生物工程學院,天津 300457;2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所,天津 300308)

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解淀粉芽孢桿菌胞外多糖發(fā)酵條件的優(yōu)化

張麗姣1,2,曾 艷2,張 穎2,宋 詼2,賈士儒1,孫媛霞2,*

(1.天津科技大學生物工程學院,天津 300457;2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所,天津 300308)

解淀粉芽孢桿菌PB6可以生產胞外多糖,通過單因素和響應面實驗,對其進行發(fā)酵優(yōu)化研究。實驗結果表明,最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖濃度400g/L、酵母粉2.5g/L、NaCl 10g/L、pH7.0;發(fā)酵條件為:接種量4%、溫度30℃、轉速150r/min、發(fā)酵時間26h。在此條件下發(fā)酵的解淀粉芽孢桿菌胞外多糖的產量可高達104.37g/L。

解淀粉芽孢桿菌,胞外多糖,響應面法,發(fā)酵優(yōu)化

基于其安全優(yōu)良的理化性能,以及產糖周期短、自然因素干擾小、產品容易分離的生產優(yōu)勢,微生物多糖在工業(yè)上受到日益重視,已作為穩(wěn)定劑、膠凝劑、成膜劑、乳化劑等被廣泛應用于食品、石油、制藥、化妝品等領域。目前市售微生物多糖包括黃原膠、結冷膠、短梗霉多糖等[1-4]。近年來微生物多糖生產的研究熱點主要集中在篩選產多糖的安全優(yōu)良菌種與發(fā)酵條件優(yōu)化提高多糖產率上。

解淀粉芽孢桿菌屬于公認安全(Generally Recognized As Safe,GRAS)菌株[5],不同來源的解淀粉芽孢桿菌產生的胞外多糖(EPS)具有不同的理化性質和生物活性。如來源于解淀粉芽孢桿菌LPL061的EPS具有良好的流變性、乳化性和熱穩(wěn)定性,還能進行免疫調節(jié)[6];來源于冬麥的解淀粉芽孢桿菌分泌的EPS能夠抑制胃癌細胞MC-4和SGC-7901生長活性[7],由此可見解淀粉芽孢桿菌胞外多糖在食品、醫(yī)藥行業(yè)具有廣闊的應用前景。然而,較低的產量會限制解淀粉芽孢桿菌多糖的潛在應用發(fā)展。如李彥巖對解淀粉芽孢桿菌LPL061進行發(fā)酵優(yōu)化后多糖產量僅為4.46g/L[8];張紅霞對產果聚糖的Cellulomonassp. GJT07進行發(fā)酵優(yōu)化后多糖產量為15g/L[9]。因此,在開發(fā)解淀粉芽孢桿菌多糖新功能的同時,如何優(yōu)化其生產條件提高產量也備受關注。

為進一步促進解淀粉芽孢桿菌胞外多糖的深入研究與工業(yè)生產開發(fā),針對本實驗室獲得的一株能夠分泌多糖的解淀粉芽孢桿菌PB6,先通過單因素實驗選取實驗因素與水平,再運用響應面分析方法(Response Surface Analysis,RSA)對PB6產胞外多糖發(fā)酵條件進行優(yōu)化,以期提高PB6的多糖產量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌PB6由中科院天津工業(yè)生物技術研究所工業(yè)酶重點實驗室篩選。

種子培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 10g/L;基礎培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、ddH2O 1L,115℃滅 20min;其他試劑均為國產分析純。

UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司;IS-RDD3臺式恒溫振蕩器 河南兄弟儀器設備有限公司;FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;D-37520離心機 美國Thermo公司;IKA RV10旋轉蒸發(fā)儀、IKA HB10數顯/控制加熱鍋 德國IKA集團/艾卡(廣州)儀器設備有限公司;SHZ-D(Ⅱ)循環(huán)水式真空泵 河南省予華儀器有限公司;FD-1-50真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 菌種活化:取-80℃低溫保存的菌種,解凍后取20μL菌液接種于5mL液體LB培養(yǎng)基試管中,37℃、200r/min活化12h,再以1%的接種量接種于種子培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)9h,作為發(fā)酵種子液。

1.2.2 解淀粉芽孢桿菌PB6的EPS提取 PB6菌株發(fā)酵液經8500r/min離心15min,去除菌體與雜質,上清液中加入3倍體積無水乙醇,4℃過夜沉淀,離心除上清,沉淀復溶后,去離子水透析3d,每隔8h換水,收集透析液,將透析液定容至一定體積,備用。

1.2.3 胞外多糖含量的測定 以葡萄糖為標品,采用苯酚-硫酸法[10]測定1.2.2所得的透析液中多糖含量。

1.2.4 解淀粉芽孢桿菌PB6產EPS單因素實驗設計

1.2.4.1 碳源種類及濃度對EPS產量的影響 分別以20g/L的蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、果糖、木糖替代基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖,其他成分不變,以蔗糖為對照。以2%的接種量于37℃、200r/min條件下培養(yǎng)24h,以EPS產量為指標,確定最適碳源。以200、250、300、350、400、450、500g/L的濃度添加蔗糖到LB液體培養(yǎng)基,作為發(fā)酵培養(yǎng)基,其余發(fā)酵條件同上,以EPS產量為指標,確定最適蔗糖濃度。

1.2.4.2 氮源種類及濃度對EPS產量的影響 分別以10g/L的牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨、檸檬酸三銨替代基礎培養(yǎng)基中的胰蛋白胨,蔗糖400g/L,NaCl 10g/L,以胰蛋白胨為對照。發(fā)酵條件同上,并測定EPS產量,確定最適氮源。以1.25、2.5、5、7.5、10g/L的濃度添加酵母粉,蔗糖400g/L,NaCl 10g/L,作為發(fā)酵培養(yǎng)基,其他同樣條件發(fā)酵,測定EPS產量,以確定最適酵母粉濃度。

1.2.4.3 無機鹽種類對EPS產量的影響 分別以10g/L的MgCl2、MgSO4、CaCl2、MnSO4、K2HPO4,代替基礎培養(yǎng)基中的NaCl,蔗糖400g/L,酵母粉2.5g/L,以NaCl為對照。發(fā)酵條件同上,測定EPS產量,以確定最適無機鹽種類。

1.2.4.4 pH、接種量、溫度、轉速及發(fā)酵時長對EPS產量的影響 選用優(yōu)化后的產糖培養(yǎng)基進行發(fā)酵條件優(yōu)化。在接種量2%、溫度37℃、轉速200r/min的條件下培養(yǎng)24h,測定發(fā)酵培養(yǎng)基不同初始pH(5、6、7、8、9)對EPS產量的影響。在培養(yǎng)基初始pH為7、溫度37℃、轉速200r/min的條件下培養(yǎng)24h,測定接種量(1、2、3、4、5、6%)對EPS產量的影響。在培養(yǎng)基初始pH7、接種量4%、轉速200r/min的條件下培養(yǎng)24 h,測定發(fā)酵溫度(25、30、35、40℃)對EPS產量的影響。在培養(yǎng)基初始pH為7、接種量4%、溫度30℃的條件下培養(yǎng)24h,測定轉速(100、150、200、250r/min)對EPS產量的影響。在pH7、接種量4%、溫度30℃、轉速150r/min的條件下培養(yǎng),測定發(fā)酵時長(12、24、36、48、60、72h)對EPS產量的影響。

1.2.5 Box-Behnken響應面設計 在單因素實驗的基礎上,選擇對EPS產量影響較大的蔗糖濃度、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時長3個因素為自變量,以EPS產量為響應值,應用Box-Behnken中心組合實驗和響應面分析法設計3因素3水平實驗方案,因子編碼及水平設計見表1[11-12]。

表1 響應面實驗因素水平表Table1 The factors and levels of the response surface experiment

1.2.6 驗證實驗 響應面實驗分析獲得PB6產胞外多糖最優(yōu)發(fā)酵工藝,以最優(yōu)條件進行3次重復發(fā)酵實驗,以驗證模型的可靠性。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分對EPS產量的影響

2.1.1 碳源種類及碳源添加量對EPS產量的影響 碳源作為細胞生長最重要的能量與營養(yǎng)來源,對芽孢桿菌EPS產量影響顯著,由圖1a可知PB6能利用多種碳源產生EPS,以蔗糖為碳源時EPS產量最高,因此選擇蔗糖做為碳源進行下一步探究。據報道,解淀粉芽抱桿菌具有較高的果聚糖蔗糖酶(Levansucrases)活性,該酶是果糖基轉移酶,能夠催化轉移非活性蔗糖的果糖殘基到果聚糖鏈上[13],因此,以蔗糖為碳源時,菌株PB6的EPS產量較高。由圖1b可知隨著蔗糖濃度的增加,PB6多糖產量也增加,蔗糖400g/L時,多糖產量最高,隨后蔗糖濃度繼續(xù)增大,EPS合成反而受到影響。

圖1 碳源種類及濃度對EPS產量的影響Fig.1 Effect of carbon source type and concentration on EPS yield

2.1.2 氮源種類及氮源添加量對EPS產量的影響 氮源主要通過影響微生物的生長速率影響EPS等次級代謝產物的合成。本實驗選擇有機氮源和無機氮源進行優(yōu)化,由圖2a可知,菌株PB6能夠利用有機氮源生產多糖,以無機氮源為唯一氮源時多糖產量極低。在4種供試有機氮源中,以酵母粉為氮源時EPS產量最高,所以選擇酵母粉作為氮源進行進一步優(yōu)化。由圖2b可知隨著酵母粉濃度的增加,PB6多糖產量也增加,酵母粉用量為2.5g/L時,多糖產量最高,隨后濃度繼續(xù)增大,營養(yǎng)成分主要用于菌體生長,EPS合成受到影響。故選擇酵母粉濃度2.5g/L做為最適氮源濃度。

圖2 氮源種類及濃度對EPS產量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source type and concentration on EPS yield

2.1.3 無機鹽種類對EPS產量的影響 參照LB培養(yǎng)基,以添加10g/L氯化鈉的培養(yǎng)基作為對照組,測定無機鹽對多糖產量的影響,結果如圖3所示。相較于氯化鈉組別,其他無機鹽的添加并沒有提高EPS產量,某些無機鹽如硫酸錳甚至對菌株有明顯的毒害作用。酵母粉中存在某些生長因子能滿足營養(yǎng)需求,添加的無機鹽離子對產糖量影響不大。因此在確定最適培養(yǎng)基配方時,不再考慮無機鹽種類,只添加10g/L的氯化鈉調節(jié)細胞滲透壓。

圖3 無機鹽種類對EPS產量的影響Fig.3 Effect of inorganic salt type on EPS yield

2.2 培養(yǎng)條件對EPS產量的影響

2.2.1 培養(yǎng)基初始pH對EPS產量的影響 通過影響菌體的細胞膜形態(tài)以及營養(yǎng)物質的離子化程度,pH能改變微生物的相關酶活性與菌體代謝途徑。因此,培養(yǎng)基過酸或過堿都會導致細胞代謝變差甚至死亡。由圖4可知,菌株PB6在pH5～9范圍內均能產多糖,pH為7時,最適合EPS的合成。故選擇pH7作為PB6最適發(fā)酵初始pH。

圖4 初始pH對EPS產量的影響Fig.4 Effect of initial pH on EPS yield

2.2.2 接種量對EPS產量的影響 接種量直接影響發(fā)酵液內的最初活菌數,從而影響菌體的生長以及EPS的生物合成量。如圖5所示,EPS產量隨著接種量增大而增加,當接種量4%時多糖產量最高,隨后接種量繼續(xù)增大EPS產量反而降低,原因是接種量過高,營養(yǎng)物質主要用于菌體生長,使得EPS的合成受到限制,從而產量降低。故選擇4%作為PB6最適發(fā)酵接種量,這一結果與蹇華麗等[14]的報道一致。

圖5 接種量對EPS產量的影響Fig.5 Effect of inoculation amount on EPS yield

2.2.3 發(fā)酵溫度對EPS產量的影響 溫度是對微生物生長繁殖和新陳代謝影響最為明顯的因素。不同微生物生長繁殖所需的最適溫度不同,同一種微生物產生不同代謝產物所需的溫度也不盡相同[15]。不同發(fā)酵溫度下EPS產量見圖6,30℃時明顯較其他溫度時產量高,推測可能是因為溫度升高或降低會影響菌體內酶的活力,從而對菌種的生長繁殖和代謝產物的積累產生影響,故選擇30℃作為PB6的最適發(fā)酵溫度。

圖6 發(fā)酵溫度對EPS產量的影響Fig.6 Effect of culture temperature on EPS yield

2.2.4 轉速對EPS產量的影響 解淀粉芽孢桿菌是好氧菌,氧氣量對細菌生長與繁殖有較大影響,氧氣量與轉速有關。不同轉速對EPS產量影響如圖7所示,搖床轉速為150r/min時,EPS產量最高。轉速過低時,氧氣量不充足,生長代謝受到抑制,產糖量較低;當轉速大于150r/min時,營養(yǎng)物質主要用于菌體增殖,產糖量降低。故選擇150r/min作為PB6的最適發(fā)酵轉速。

圖7 發(fā)酵轉速對EPS產量的影響Fig.7 Effect of fermentation speed on EPS yield

2.2.5 發(fā)酵時長對EPS產量的影響 不同發(fā)酵時間對EPS產量的影響見圖8,隨著發(fā)酵時間的延長,EPS產量迅速增加,在24h左右達到最高,之后24～48h EPS產量變化不大,可能發(fā)酵達到平衡,之后再延長發(fā)酵時間EPS產量開始降低,這可能是延長發(fā)酵時長會導致EPS被酶降解的緣故[16]。故選擇24h作為PB6的最適發(fā)酵時長。

圖8 發(fā)酵時長對產量的影響Fig.8 Effect of culture time on EPS yield

2.3 響應面分析法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌EPS發(fā)酵條件

2.3.1 響應面實驗結果 根據Box-Bohnken實驗設計進行三因素三水平的響應面分析實驗,實驗設計及結果見表2,共17個實驗點,其中12個析因點,5個零點。

表2 響應面實驗設計及結果Table2 Experiment design and result of response surface method

2.3.2 響應曲面方差分析 響應面實驗中對多糖產量進行擬和的二次模型方差分析見表3。

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table3 Analysis of variance(ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

注:*：差異顯著(p<0.05),**：差異極顯著(p<0.01)。

2.3.3 響應面分析及最優(yōu)培養(yǎng)條件的確定 根據響應面圖可以直觀、高效地找到最佳參數、各參數之間的相互作用和最大響應值。從響應面方程所得響應面圖與等高線圖如圖9所示。

圖9 兩因素交互影響的響應面圖Fig.9 Response surface of the combined effects of sucrose concentration,culture temperature and time on EPS yield

由圖可知發(fā)酵溫度對EPS產量影響最大,表現為曲面最陡,發(fā)酵時長與蔗糖濃度對EPS產量也有顯著性影響,但曲面較平。這與回歸方程的計算值是完全一致的。利用Design Expert 8.0進行優(yōu)化分析,得出菌株PB6產EPS最佳條件為:蔗糖濃度406.7g/L、發(fā)酵溫度30.7℃、發(fā)酵時長25.6h,在此條件下理論預測最大值為108.11g/L。為便于實際操作,將以上條件修正為:蔗糖濃度400g/L、溫度30℃、發(fā)酵時長26h。采取修正后的優(yōu)化條件進行PB6發(fā)酵的驗證實驗,測得EPS產量為104.37g/L,達到預測值的96.54%,可見該模型具有較好的預測性和實用性。PB6菌株胞外多糖產量在目前所報道的數據中處于前列,具有工業(yè)化應用潛力,但是目前培養(yǎng)基中高濃度的蔗糖使得培養(yǎng)基成本較高,需要進一步尋求糖蜜、工農業(yè)廢料等更為廉價且發(fā)酵效果良好的培養(yǎng)基[17-19]。

3 結論

通過單因素實驗及響應面實驗對解淀粉芽孢桿菌PB6產胞外多糖發(fā)酵條件進行研究,得出最佳發(fā)酵條件為:蔗糖400g/L、酵母粉2.5g/L、NaCl 10g/L、初始pH7、接種量4%、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵轉速150r/min、發(fā)酵周期26h,在此條件下多糖產量可達到104.37g/L,經檢測證明該模型是可靠的。

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Optimization of fermentation conditions for production of exopolysaccharide byBacillusamyloliquefaciensPB6

ZHANG Li-jiao1,2,ZENG Yan2,ZHANG Ying2,SONG Hui2,JIA Shi-ru1,SUN Yuan-xia2,*

(1.College of Biology Engineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Tianjin 300308,China)

For the production of exopolysaccharide(EPS)fromBacillusamyloliquefaciensPB6,single-factor test and response surface methodology(RSM)were adopted to optimize the fermentation conditions. The results showed that the optimal medium components were consisted of 400g/L sucrose,2.5g/L yeast extract and 10g/L NaCl at an initial pH of 7. The optimal fermentation conditions were 4% inoculum amount,culture temperature of 30℃,shaking speed of 150r/min and incubation time of 26h. Under the optimized conditions,a maximum EPS yield of 104.37/L was achieved.

Bacillusamyloliquefaciens;exopolysaccharide;response surface methodology;fermentation condition optimization

2014-08-11

張麗姣(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物多糖生產與功能研究。

*通訊作者:孫媛霞(1963-)，女，博士，研究員，研究方向：功能糖與天然活性物質。

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(2012AA021403)；中國科學院重點部署項目(KSZD-EW-Z-019)。

TS201.3

B

:1002-0306(2015)09-0214-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.038