曾延源姚聲濤*蒲 舉

（1、貴州省遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563000；2、貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000）

?綜述及其他?

遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)腦缺血的保護(hù)及相關(guān)機(jī)制

曾延源1、2姚聲濤1、2*蒲 舉1、2

（1、貴州省遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563000；2、貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000）

對(duì)于急性中風(fēng)患者施行早期有效的溶栓治療，恢復(fù)缺血腦組織的血流和功能已成為臨床公認(rèn)有效的治療手段。但溶栓治療有嚴(yán)格的時(shí)間窗限制，且并發(fā)癥很多，為了解決這一難題，“缺血預(yù)適應(yīng)”對(duì)腦組織缺血／再灌注損傷保護(hù)作用的研究進(jìn)入了人們的視線。目前已有研究證明遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)的腦保護(hù)作用。但作用機(jī)制尚不明確。因此本課題的目的是應(yīng)用遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)模型即腦缺血后給予遠(yuǎn)隔器官（雙下肢缺血處理）研究遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)腦缺血的保護(hù)作用及機(jī)制?；诩韧难芯拷Y(jié)果，我們提出了這樣假說(shuō)：腦缺血再灌注時(shí)給予雙側(cè)或單側(cè)下肢的缺血可以對(duì)腦缺血造成的損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能是多方面，一方面，可能通過(guò)減輕缺血再灌注的損傷，從而減輕了缺血引起的血腦屏障的損傷；另一方面，可能遠(yuǎn)隔器官的缺血產(chǎn)生了神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)。本課題研究，為將來(lái)急性腦梗塞的臨床治療，特別是通過(guò)神經(jīng)保護(hù)治療措施，延長(zhǎng)治療時(shí)間窗提供新的理論依據(jù)。

遠(yuǎn)隔缺血；腦缺血的保護(hù)；血腦屏障，相關(guān)機(jī)制

腦缺血會(huì)對(duì)神經(jīng)元造成不可逆的損傷，目前對(duì)于此疾病研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)就是尋找對(duì)于神經(jīng)損傷有效的預(yù)防治療方法。目前，公認(rèn)的有效減輕缺血/再灌注損傷的方法有缺血預(yù)適應(yīng)，是指機(jī)體在經(jīng)歷一次或數(shù)次短暫性缺血會(huì)使內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制被激發(fā)，減輕缺血對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的嚴(yán)重?fù)p傷[1-3]。1985年Murry[4]在對(duì)于犬的心臟缺血模型研究中提出缺血預(yù)適應(yīng)，此后，缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)腦組織的保護(hù)作用在大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)，但由于臨床上難以預(yù)測(cè)缺血事件的發(fā)生，所以限制了其在臨床的應(yīng)用。缺血后適應(yīng)的提出彌補(bǔ)了缺血預(yù)適應(yīng)在臨床應(yīng)用的不足，缺血后適應(yīng)是在長(zhǎng)期缺血之后，進(jìn)行再灌注之前，給予短暫性的、重復(fù)非致死性的預(yù)缺血。腦缺血的預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)保護(hù)機(jī)制是人體內(nèi)固有的內(nèi)源性自我保護(hù)機(jī)制。其可以減少在再灌注損傷過(guò)程中觸發(fā)因素的發(fā)生，常見(jiàn)的有促炎癥細(xì)胞因子、中性粒細(xì)胞、氧化、粗凋亡因子等，使對(duì)于靶細(xì)胞的損傷和凋亡情況發(fā)生減少，梗死面積縮小。遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)腦有重要的保護(hù)意義，是目前公認(rèn)的對(duì)于急性中風(fēng)患者早期溶栓，使血腦組織供血得以恢復(fù)的有效治療手段。但應(yīng)用中存在兩個(gè)問(wèn)題，一個(gè)是時(shí)間窗的問(wèn)題，另一個(gè)是再灌注損傷，其成為對(duì)溶栓效果重要的影響因素，會(huì)使處于缺血的神經(jīng)細(xì)胞在血流恢復(fù)后出現(xiàn)死亡。所以對(duì)于溶栓時(shí)間窗的延長(zhǎng)可以使再灌注損傷的情況減輕，但這是臨床有待解決的問(wèn)題。近些年隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，腦血管經(jīng)皮介入技術(shù)的研究應(yīng)用，后適應(yīng)性的臨床應(yīng)用提供了可能性。本研究通過(guò)測(cè)定腦組織、腦脊液、血液里MMPs、VEGF、BDNF、GDNF的mRNA表達(dá)及蛋白含量，證明遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)缺血/再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制為減輕血腦屏障損傷及產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)因子。

1 材料與試劑

Sprague Dawley遠(yuǎn)交群大鼠(SD大鼠)共計(jì)200只，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；ELISA檢測(cè)試劑盒，由上海寶曼生物科技有限公司提供。

1.1 動(dòng)物模型建立

應(yīng)用缺血/再灌注損傷大鼠模型制備穩(wěn)定的大鼠雙下肢的遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)模型。

1.2 遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)腦缺血保護(hù)的研究

通過(guò)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估及腦梗死體積變化證明遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用

1.3 指標(biāo)測(cè)定

測(cè)定腦組織、腦脊液、血液里MMPs、VEGF、BDNF、GDNF的mRNA表達(dá)及蛋白含量，證明遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)缺血/再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制為減輕血腦屏障損傷及產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)因子。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠腦缺血60min、90min、120min后再灌注同時(shí)給予遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)。探討缺血后適應(yīng)的保護(hù)作用是否與腦缺血的嚴(yán)重程度有關(guān)，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)；遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)腦缺血的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)分組：SD大鼠120只，隨機(jī)分為10組，每組12只。假手術(shù)組：僅暴露頸動(dòng)脈；對(duì)照組：行單純?nèi)毖俟嘧ⅲ淮笫竽X缺血60min，予遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)干預(yù)，再灌注后24h、72h、4w三組，大鼠腦缺血90min，予遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)干預(yù)，再灌注后24h、72h、4w三組，大鼠腦缺血120min，予遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)干預(yù)，再灌注后24h、72h、4w三組。大鼠腦缺血后再灌注不同時(shí)間點(diǎn)（早期24h及晚期4w），重新制作模型留取幾組標(biāo)本，包括腦組織、腦脊液及血液，電鏡檢查血腦屏障的損傷，并測(cè)定腦干濕比重。測(cè)定血液及腦脊液、MMPs、VEGF、BDNF以及GDNF的表達(dá)。免疫組化染色定位腦組織NeuN、MMPs、VEGF、BDNF以及GDNF的表達(dá)。Western Blot定量MMPs、VEGF、BDNF以及GDNF。采用雙盲法用無(wú)偏見(jiàn)細(xì)胞立體學(xué)定量分析免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，用方差分析差異（ANOVA）及post hoc Student-Newman-Keul檢測(cè)進(jìn)行分析，P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。用光密度掃描對(duì)Western Blot條帶進(jìn)行半定量分析，與對(duì)照組光密度倍數(shù)的差異用方差分析（ANOVA）及post hoc Student-Newman-Keul進(jìn)行分析血液、腦脊液以及腦組織各種因子的變化及相關(guān)關(guān)系。

2.2 研究遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)腦缺血血腦屏障損傷及神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)的影響

遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)腦缺血保護(hù)機(jī)制實(shí)驗(yàn)分組：SD大鼠80只，隨機(jī)分8組，每組10只。假手術(shù)組：僅暴露頸動(dòng)脈；對(duì)照組：行單純?nèi)毖俟嘧?；大鼠腦缺血60min，予遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)干預(yù)，再灌注后24h、4w兩組大鼠腦缺血90min，予遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)干預(yù)，再灌注后24h、4w兩組大鼠腦缺血120min，予遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)干預(yù)，再灌注后24h、4w兩組。大腦缺血60min，90min，120min再灌注損傷模型再灌注即給予雙側(cè)股動(dòng)脈夾閉10min，放松10min，重復(fù)3次。分別于再灌注后24h，72h，4w，進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，用方差分析差異（ANOVA）及post hoc Student-Newman-Keul檢測(cè)進(jìn)行分析，P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在灌注后24h，72h，4w處死大鼠TTC染色測(cè)定腦梗死體積，用方差分析差異（ANOVA）及post hoc Student-Newman-Keul檢測(cè)進(jìn)行分析。

圖1 MCAO模型

圖2 TTC染色測(cè)定腦梗死體積

圖3 電鏡檢查血腦屏障損傷

圖 4 The comparision of CBF at different time points.A: before MCA occlusion;B:0 min after MCA occlusion;C:10 mins after MCA occlusion;D:1h after MCA occlusion;E:0 min after MCA reperfusion;F:1st of CCA occlusion;G:1st of CCA reperfusion;H:2nd of CCA occlusion;I:2nd of CCA reperfusion;J:3rd ofCCA occlusion;K:3rd ofCCA occlusion;L:4th ofCCA occlusion;M:4th ofCCA reperfusion;N:5th ofCCA occlusion;O:5th ofCCA reperfusion;P:30 min after MCA reperfusion.The CBF of the control,u-CCA-O,and b-CCA-O group are analyzed using one-way ANOVA.(±s).n=7.

圖 5 The comparision of functional neurological outcome at different time points.The functional neurological outcome of control,u-CCA-O,and b-CCA-O group are analyzed at 1h after MCA occlusion using one-way ANOVA,（±s）,n=7,○: P=0.000<0.05 vs control;△:P=0.008<0.05 vs control.

3 結(jié)果

3.1 本研究室具備穩(wěn)定的MCAO模型，如圖1

3.2 我們?cè)谌瘫O(jiān)測(cè)各項(xiàng)生理指標(biāo)以及腦血流的情況下建立了雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉的缺血后適應(yīng)模型，在此基礎(chǔ)上研究了缺血后適應(yīng)對(duì)腦缺血的保護(hù)作用及機(jī)制。發(fā)現(xiàn)：（1）缺血后適應(yīng)不影響血壓、血糖、血?dú)庖约绑w溫?zé)o影響。（2）雙側(cè)頸總動(dòng)脈缺血后適應(yīng)可能會(huì)減少再灌注時(shí)的腦血流過(guò)灌注現(xiàn)象（見(jiàn)圖2）。（3）雙側(cè)頸總動(dòng)脈缺血后適應(yīng)減少了神經(jīng)功能的缺損程度（見(jiàn)圖3）。（4）雙側(cè)頸總動(dòng)脈缺血后適應(yīng)降低了腦梗死體積（見(jiàn)圖4-6）。

圖 6 The comparision of the infarct volume.The infarct volume of control,u-CCA-O,and b-CCA-O group are analyzed using one-way ANOVA,（±s）,n=7,□:P=0.001< 0.05 vs control;△:P=0.000<0.05 vs control.

3 討論

遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)（Remoteischemicpreconditioning，RPC）以及缺血后適應(yīng)的所有研究結(jié)果使我們?cè)谀X缺血的研究中寄希望于遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)（remote ischemic postconditioning），即為了治療腦缺血性損傷，在腦缺血性損傷后，給于其他某一器官短暫的亞致死性IR，例如肢體，能夠在遠(yuǎn)隔臟器，如腦產(chǎn)生缺血保護(hù)。遠(yuǎn)距離缺血后適應(yīng)是機(jī)體對(duì)自身?yè)p傷的一種天然保護(hù)機(jī)制，其可以通過(guò)機(jī)體不太重要的器官例如肢體來(lái)進(jìn)行后適應(yīng)干預(yù)，從而保護(hù)心臟和腦等重要器官的損傷，臨床應(yīng)用價(jià)值較大。目前已有研究證明遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)的腦保護(hù)作用。但作用機(jī)制尚不明確。

因此本課題的目的是應(yīng)用遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)模型即腦缺血后給予遠(yuǎn)隔器官（雙下肢缺血處理）研究遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)腦缺血的保護(hù)作用及機(jī)制。基于既往的研究結(jié)果，我們提出了這樣假說(shuō)：腦缺血再灌注時(shí)給予雙側(cè)或單側(cè)下肢的缺血可以對(duì)腦缺血造成的損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能是多方面，一方面，可能通過(guò)減輕缺血再灌注的損傷，從而減輕了缺血引起的血腦屏障的損傷；另一方面，可能遠(yuǎn)隔器官的缺血產(chǎn)生了神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)。

本課題研究，為將來(lái)急性腦梗塞的臨床治療，特別是通過(guò)神經(jīng)保護(hù)治療措施，延長(zhǎng)治療時(shí)間窗提供新的理論依據(jù)。

遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)腦有重要的保護(hù)意義，是目前公認(rèn)的對(duì)于急性中風(fēng)患者早期溶栓，使血腦組織供血得以恢復(fù)的有效治療手段。但應(yīng)用中存在兩個(gè)問(wèn)題，一個(gè)是時(shí)間窗的問(wèn)題，另一個(gè)是再灌注損傷，這兩者嚴(yán)重影響著患者的溶栓效果，易導(dǎo)致缺血狀態(tài)下的神經(jīng)細(xì)胞在恢復(fù)血流后出現(xiàn)死亡。所以對(duì)于溶栓時(shí)間窗的延長(zhǎng)可以使再灌注損傷的情況減輕，但這是臨床有待解決的問(wèn)題。近些年隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，腦血管經(jīng)皮介入技術(shù)的研究應(yīng)用，后適應(yīng)性的臨床應(yīng)用提供了可能性。

［1］ Matsushima K，Hakim AM．Transient forebrain ischemia protects against subsequentfocal cerebral ischemia without changing cerebral perfusion[J].Stroke，1995,26(6)：1047-1052．

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Distant postconditioning protection and related mechanisms of cerebral ischemia

Zeng YanYuan1、2,YaoShengTao1、2*,Pu Ju1、2
（1.Hospital Affiliated Zunyi Medical College;Guizhou Zunyi 563000 2.Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563000）

For patients with acute stroke early and effective implementation of thrombolytic therapy to restore blood flow and function of ischemic brain tissue has become recognized as an effective clinical treatment.Thrombolytic therapy but there are strict time window constraints,and a lot of complications,in order to solve this problem,"ischemic preconditioning"The study of cerebral ischemia/reperfusion injury into the people's attention.At present,studies have shown that the protective effect of adaptation after ischemic brain distant.But the mechanism is not clear.So the purpose of this project is to adapt the model after applying distant ischemic cerebral ischemia given that distant organs(double limb ischemia treatment)study distant after ischemia protective effect and mechanism of adaptation cerebral ischemia. Based on previous findings,we propose such a hypothesis:given bilateral or unilateral lower limb ischemia can cause damage to the brain has a protective effect of ischemic cerebral ischemia and reperfusion,the protective mechanism may be multifaceted,on the one hand probably by reducing ischemia-reperfusion injury,thus reducing the blood-brain barrier damage caused by ischemia;on the other hand,may be distant organ ischemia produced a neuroprotective substances.This research for future clinical treatment of acute cerebral infarction,particularly through neuroprotective treatment,prolonged treatment time window to provide a new theoretical basis.

Distant ischemia;cerebral ischemia protection;mechanisms

曾延源，1982年生，男，漢族，研究生，住院醫(yī)師，主要從事神經(jīng)病學(xué)方面工作。

*姚聲濤為本文通訊作者。