申 利

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高效液相色譜-串聯質譜法同時篩查人尿中40種世界反興奮劑機構禁用藥物

申 利

運用酸水解-液液萃取及直接液液萃取相結合的方法對尿樣進行前處理，建立了同時篩查WADA《禁用清單》中β-阻斷劑和麻醉劑，部分刺激劑及β2-激動劑的檢測方法。涵蓋藥物40種，檢出限范圍分布在0.1～10 ng/mL，在低濃度、WADA技術文件要求最低檢測濃度(MRPL)和高濃度時相對回收率分布在1.6%～118.6%。解決了實驗室原有方法不能達到技術文件MRPL的問題，在快速篩查尿樣時效果良好。方法靈敏、簡單、經濟、快速，結果準確可靠。

高效液相色譜-質譜聯用；β-阻斷劑；麻醉劑；刺激劑；β2-激動劑；多重反應監(jiān)測

1 前言

世界反興奮劑機構(以下簡稱“WADA”)每一年度都會頒布即時的《禁用清單》，涵蓋的禁用物質包括12大類，禁用物質原型總數超過200個。實際工作中除檢測禁用物質外，還要求檢測其各級代謝物和相關化合物及其代謝物，整個實驗室需定性檢出的化合物總數超過400個[12]，這就要求實驗室的初篩應盡可能的用一種方法同時定性檢出較多的藥物。在《禁用清單》中，WADA 規(guī)定禁用β-阻斷劑20個，麻醉劑11個，刺激劑66個，β2-激動劑6個，中國反興奮劑中心檢測實驗室先前檢測這些禁用物質是采用了傳統(tǒng)的氣相色譜/質譜聯用(GC/MS)技術[1,7,8,9],方法可滿足以前的要求。近年來，WADA技術文件[11]對檢測靈敏度的要求越來越高，新版本對各類禁用物質的最低檢測濃度要求(MRPL)均有很大的提高，有些物質的MRPL甚至是原來的1/10。本實驗室原有的檢測方法已不能達到WADA技術文件的要求，日常檢測及WADA外部質量控制評估計劃工作中存在著極大的隱患。本研究即選取40種禁用物質作為研究對象建立新的檢測方法。這些藥物的共同特征為：1)現有實驗室檢測方法不能全部滿足技術文件要求；2)原形和/或其代謝物為以結合型(葡萄糖醛酸甙或硫酸酯)和游離型兩種形式，但主要以結合形式在尿中存在[2]；3)分子極性較大，不易揮發(fā)，GC/MS檢測需先進行衍生化，尿樣前處理步驟繁瑣。

近年來，液相色譜-質譜聯用技術(HPLC/MS)日漸成熟，在分析化學領域取得了大范圍的應用，越來越多的興奮劑檢測實驗室采用液質方法[3-5]進行這幾類物質的檢測。但WADA各實驗室禁用物質分類和尿樣前處理步驟各行其道，所用儀器也不盡相同[4,6,10]。為了保持我實驗室在興奮劑檢測領域的檢測資格和技術領先地位，保證檢測結果的準確可靠，進行液質檢測方法的研究十分必要。本研究選取了所有β-阻斷劑和麻醉劑，以及7個刺激劑和3個β2-激動劑作為研究對象，充分利用了實驗室現有的儀器和試劑，運用鹽酸水解-液液萃取及直接液液萃取相結合的方法對尿樣進行前處理，利用高效液相色譜-串聯四級桿質譜聯用技術，建立了同時篩查WADA禁用清單中β-阻斷劑和麻醉劑，部分刺激劑及β2-激動劑的檢測方法。

2 實驗部分

2.1 儀器和設備

6410 Triple Quad LC-MS：美國Agilent公司產品；色譜柱：Agilent Zorbax XDB-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm×3.5 μm)，美國Agilent公司產品；電子天平：瑞士Mettler Toledo公司產品；Dri-block DB-3D氮氣吹干裝置：美國Techne公司產品；低速離心機：美國Thermo公司產品；低溫恒溫液浴循環(huán)兩用槽：杭州雪中炭恒溫技術有限公司產品；超純水機：美國Millipore公司產品；振蕩器：德國Gmbh&Co.KG公司產品； Finnpipette系列取液器：美國Thermo-Finnpipette公司產品。電熱鼓風干燥箱：國產。

2.2 試劑與材料

標準品來源見表1。

表1 本研究實驗對象及禁用物質標準品來源一覽表Table 1 The Subjects and Source of Reference Standards

注：乙腈、甲醇、甲酸胺、甲酸(色譜純):DIKMA TECHNOLOGY Inc.美國。L-半胱氨酸(L-Cysteine)及其余均為國產分析純試劑。

2.3 陽性尿的配制

準確稱取各種禁用物質的標準品1 mg，配制成1 mg/mL甲醇溶液作為標準儲備溶液，再以甲醇為溶劑倍比稀釋成10 ng/μL 的標準品溶液備用。按照表1中各類禁用物質的MRPL要求，準確量取標準品溶液，分4組配制成混合標準溶液，量取該溶液，加入3 mL空白尿樣，按照各自的MRPL配成混合控制尿樣。

2.4 實驗方法

2.4.1 樣品前處理

1.尿樣3 mL,加10 μL內標甲醇溶液(甲基睪酮，10 ng/μL)，加入約50 mg L-半胱氨酸和0.2 mL濃鹽酸(約14 mol/L)，100℃水解30 min，冷卻后加0.25 mL 12 mol/L NaOH溶液中和，再加入約1.5 g固體緩沖劑(NaHCO3/K2CO3=3/2,w/w,pH=9.6)和3 mL提取液(乙醚/異丙醇=9/1,v/v)萃取，留取有機相備用。

2.尿樣3 mL,加10 μL內標甲醇溶液(甲基睪酮，10 ng/μL)，加入約1.5 g固體緩沖劑和3 mL提取液萃取，留取有機相備用。

3.合并1和2的有機相，60℃氮氣流下吹干，用初始流動相溶解定容至500 μL，進樣10 μL 于LC-MS/MS。

2.4.2 實驗條件

1.色譜條件：Agilent Zorbax XDB-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm×3.5 μm)；柱溫40 ℃；流動相采用pH 3.5的甲酸胺緩沖液(A)和乙腈(B)進行梯度洗脫；洗脫梯度：0～1 min:95%A～5%B，1～7 min:30%A～70%B；7～8 min:0%A～100%B，9 min:0%A～100%B。流速0.4 mL/min，運行9 min，平衡4.5 min；進樣量10 μL。

2.質譜條件：多反應離子監(jiān)測(MRM)；離子化方式：電噴霧(ESI)；離子極性：正離子模式；毛細管電壓：4 000 V；干燥器溫度：330 ℃；干燥器流速：10.0 L/min；定性分析采用離子對(母離子和兩個子離子)信息比較和保留時間比較。

3 結果與討論

3.1 質譜條件的選擇

根據此類物質的結構特征，選擇正離子模式。通過對各個禁用物質單標溶液分別進樣進行一級質譜掃描，確定其準分子離子峰，并分別優(yōu)化每種物質的錐孔電壓。分別以其準分子離子峰為母離子，通過不同的碰撞電壓產生碎片進行二級質譜掃描，選擇豐度較高的兩個碎片離子作為定性特征離子，同時優(yōu)化其碰撞能量。鑒于采集的離子對較多，為了保證檢出靈敏度，質譜檢測在0～5 min，5～9 min進行分段采集(表2)。

表2 本研究禁用物質檢測的色譜及質譜條件一覽表Table 2 HPLC-MS/MS Conditions

3.2 色譜條件的優(yōu)化

綜合文獻[3,5]以及實驗結果，選擇乙腈/水作為流動相體系。在流動相中添加緩沖鹽調節(jié)系統(tǒng)的pH值。由于本研究的目的側重用較短的時間盡量分析較多的物質和較多的樣品，而涉及的禁用物質分子量大小分布范圍較寬，保留情況各不相同，所以，通過不同的洗脫梯度比較，確定了乙腈的起始濃度為5%，最終濃度為100%，運行時間為9 min的梯度洗脫條件，通過調節(jié)不同時間段內的流動相配比，盡量使40種禁用物質達到比較良好的分離。由于興奮劑檢測工作要求快速出結果，所以，選用了較短的色譜柱，較短的運行時間，而初篩采用的MRM模式減少了各個禁用物質定性離子間的相互干擾，即使在色譜分離不理想的情況下，也能得到較好的分析結果(表2)。

3.3 尿樣前處理方法的選擇

文獻報道[2]本研究涉及的3種β2-激動劑幾乎全部以硫酸酯結合形式存在于尿中，實驗中發(fā)現，從尿中提取前需進行酸水解方可游離出檢測物質。試驗中涉及的麻醉劑和刺激劑及β-阻斷劑在尿中排泄時的結合方式為葡萄糖醛酸甙結合，實驗表明，酸水解、酶水解均可較好地游離出檢測物，為了同時檢出這些物質，最后選擇成本較低，操作簡單的酸水解方法。實驗中發(fā)現，bisoprolol,atenolol，pindolol，timolol,esmolol,dextromoramide,methadone,oxycodone,pethidine等禁用物質在強酸條件下可能被破壞，所以，采用了另取一份尿樣直接提取后與水解后提取的樣品合并的方法，兼顧到了所有涉及到的物質，結果較為理想。

3.4 方法的回收率和檢出限

1.按照每種藥物的20% MRPL，MRPL和500% MRPL配制相應濃度的控制尿樣各10份，按照前述方法進行前處理，與等量的標準品溶液平行進樣，提取各個藥物的豐度較高的子離子積分得到峰面積，比較得出提取回收率(平均值，表3)。

2.配制一系列較低濃度的控制尿樣，按照前述方法進行前處理，提取后進樣，提取豐度較低的子離子，根據信噪比計算得出禁用物質的尿中檢出限(S/N=5，表3)。

表3 本研究藥物的回收率和檢出限一覽表Table 3 The Limits of Detection and the Recoveries at Different Concentrations

續(xù)表 3

注：* Benzoylecgonine為cocaine的主要代謝物，為尿中的必要檢測物質，本方法對此物質的提取回收率極低，但由于其良好的質譜響應，使得2%的回收率仍能獲得4 ng/mL的尿中檢出限，滿足檢測初篩要求，如果初篩檢測尿樣中發(fā)現此物質疑似陽性，進行確證時本實驗室采取不同的提取方法。這也符合WADA的技術文件要求。

部分禁用物質在20% MRPL濃度時的MRM圖見圖1。

圖1 本研究20% MRPL 濃度下部分禁用物質的MRM示意圖Figure 1. The MRM Chromatograms of Several Prohibited Substances at 20% MRPL Concentration

3.5 精密度

選取了benzoylecgonine,ethamivan,fentanyl,metoprolol,nadolol,propranolol和terbutaline等7種較為易得的禁用物質進行方法的精密度實驗，這7種物質保留時間和提取回收率分布在不同區(qū)域，也是陽性率較高或檢出較為困難的禁用物質。配置20% MRPL濃度、MRPL濃度和500% MRPL濃度的控制尿樣，分別由2名實驗人員各取5份平行進行分析，提取豐度較高的子離子積分得到峰面積，計算其CV得到日內精密度。按照日內精密度的操作方法，每天進行1次實驗，共3天，計算CV 得到日間精密度。結果均小于15%，符合技術文件要求，證明本檢測方法穩(wěn)定可靠。

3.6 基質干擾

收取50份空白尿樣，按照本研究中方法進行化學前處理及LC-MS/MS檢測分析，觀察待測離子窗口，所有窗口均無明顯干擾。

3.7 實際樣品檢測

目前，本實驗室已經采用此方法對實驗室的所有常規(guī)樣品進行檢測，發(fā)現本研究開發(fā)的LC-MS/MS方法檢測陽性質控樣品結果準確無誤，離子清晰易見，陰性樣品在所有窗口均無明顯干擾。到目前為止，檢測樣品超過2萬例，檢出包括WADA 外部質量評估計劃樣品在內的陽性樣品數10例，初篩結果靈敏度高，干擾小，圖譜清晰。

4 結論

本研究建立的液相色譜-串聯質譜同時檢測40種WADA禁用物質的方法，選擇性好，靈敏度高。與原有的氣相色譜/質譜聯用方法比較，具有以下優(yōu)勢：1)靈敏度大幅提高，完全滿足了WADA最新的最低檢測要求(MRPL)；2)無需進行衍生化，前處理方法簡化，時間縮短了1 h以上，降低了工作量，減低了工作人員因為接觸衍生化試劑而潛在的健康威脅；3)對每一個樣品而言，儀器分析時間縮短了10 min，這對興奮劑檢測工作的時效性十分重要；4)方法選擇性好，無干擾，結果一目了然，降低了結果處理的工作強度；5)消除了實驗室檢測工作中的重大隱患。

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Simultaneous Detection of 40 WADA Prohibited Substances in Human Urine by High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry

SHEN Li

A high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry method was developed for a simultaneous detection of 40 prohibited substances,covered β-blockers and narcotics,some stimulants and β2-agonists which are included in the prohibited list issued by the World Anti-Doping Agency (WADA).After the pretreatment with acid hydrolysis,extraction and enrichment procedures,the urine sample was injected to the LC-MS/MS.The limits of detection were between 0.1～10 ng/mL according to different substances.The spiked recoveries at low concentration,WADA Minimum Required Performance Levels (MRPL) and high concentration were within the range of 1.6% to 118.6%.This method was a simple,fast,effective and reliable solvent to our laboratory and now has been successfully applied to the routine analysis and the External Quality Assessment Scheme set out by WADA.

highperformanceliquidchromatography-massspectrometry;β-blockers;narcotics;stimulants;β2-agonist;multiplereactionmonitoring

1000-677X(2015)05-0066-05

10.16469/j.css.201505009

2014-12-02；

2015-03-16

國家體育總局重點領域研究課題(2013B002)。

申利(1969-)，女，河北石家莊人，副研究員，碩士，主要研究方向為興奮劑檢測新方法，Tel：(010)84376803，E-mail：shenli@chinada.cn。

國家體育總局 反興奮劑中心，北京 100029 China Anti-doping Agency,Beijing 100029,China.

G804.7

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