★ 陳阿虹 柳慶龍 孫照霞

(1.福建中醫(yī)藥大學藥學院 福州 350122； 2.福建中醫(yī)藥大學福建中西醫(yī)結合研究院 福州 350122)

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復方益節(jié)健片中淫羊藿苷和丹參酮ⅡA的TLC鑒別和HPLC含量測定

★ 陳阿虹1柳慶龍1孫照霞1

(1.福建中醫(yī)藥大學藥學院 福州 350122； 2.福建中醫(yī)藥大學福建中西醫(yī)結合研究院 福州 350122)

目的：建立復方益節(jié)健片中淫羊藿苷和丹參酮ⅡA的TLC鑒別和HPLC含量測定方法，為完善復方益節(jié)健片質量標準提供參考。方法：采用薄層色譜法對淫羊藿和丹參進行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定處方中的淫羊藿苷和丹參酮ⅡA的含量。色譜條件：采用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為水-乙腈，梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為270 nm；進樣量為10 μL。結果：淫羊藿苷和丹參酮ⅡA分別在10～50 μg/mL(r=0.999 8,n=5)和4～20 μg/mL(r=0.999 8,n=5)范圍內線性關系良好，平均回收率分別為97.82%和96.77%，RSD分別為1.14和1.80。結論：本方法專屬性、重復性好，可用于復方益節(jié)健片的質量控制。

復方益節(jié)健片；薄層色譜法；高效液相色譜法；淫羊藿；丹參

復方益節(jié)健片是由淫羊藿、熟地黃、牛膝、丹參等中藥材提取加工而成，并添加生物碳酸鈣、酪蛋白磷酸肽等為原料，是一種適宜中老年人服用的保健品，具有增加骨密度的作用。雖然本品以中藥為原料，安全且無礙，但中藥藥效的發(fā)揮是多組分共同作用的結果，有效成分的含量會直接影響藥物的效果，建立合理的質量標準，能更好的提高藥物的質量。淫羊藿為方中的君藥，研究表明其指標性成分淫羊藿苷能夠提高骨密度，預防骨質疏松[1]。方中的丹參則具有活血痛經的功效，其有效成分為丹參酮ⅡA[2]。參考文獻報道，筆者以淫羊藿苷和丹參酮ⅡA為指標建立定性定量方法，以期完善復方益節(jié)健片的質量標準。

1 儀器與試藥

日本島津LC-20A高效液相色譜(四元泵、柱溫箱、自動進樣器、DAD檢測器、日本島津公司)；ZF-I型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)；FA-1004型電子天平(上海天平儀器廠)；硅膠G、H薄層板(青島海洋化工廠)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司)。

復方益節(jié)健片(片仔癀藥業(yè)股份有限公司提供，批號：140217,140218,131212)；淫羊藿苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110737-201012)；丹參酮ⅡA(中國食品藥品檢定研究院，批號：110766-200518)。

乙腈(色譜純，美國默克公司)；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 復方益節(jié)健片的TLC鑒別

2.1.1 淫羊藿的TLC鑒別[3]取本品10片，除去包衣，研細，取約1 g，置于錐形瓶中，加入乙醇10 mL超聲20 min，濾過，濾液蒸干，用適量的乙醇溶解，作為供試品溶液。取淫羊藿苷對照品，用乙醇溶解，配制成1 mg/mL的對照品溶液。另按處方配比，取缺淫羊藿的其他各味藥，制成淫羊藿陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10:1:1:1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的暗紅色斑點；噴以5% AlCl3溶液，再置紫外光燈(365 nm)下檢視，顯相同的橙紅色熒光斑點，陰性對照無干擾。結果見圖1。

1-3.供試品；4.淫羊藿苷；5.陰性對照

2.1.2 丹參的TLC鑒別[3]取本品10片，除去包衣，研細，取約1 g，置于錐形瓶中，加乙醚20 mL，超聲20 min，濾過，濾液揮干，殘渣用適量的乙酸乙酯溶解，作為供試品溶液。取丹參酮ⅡA對照品，加乙酸乙酯配置成2 mg/mL的對照品溶液。另按處方配比，取缺丹參的其他各味藥制成丹參陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4:1)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的暗紅色斑點，且陰性對照無干擾。結果見圖2。

2.2 HPLC測定復方益節(jié)健片中2種有效成分的含量

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫：0～13 min時，B為28%，13～23 min時，B由28～85%，23～35 min時，B為85%；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：270 nm；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應不低于1500。專屬性試驗符合要求，結果見圖3。

1-3.供試品；4.丹參酮ⅡA；5.陰性對照

1.淫羊藿苷；2.丹參酮ⅡA；A.復方益節(jié)健片；

B.混合對照品；C.陰性樣品

圖3 HPLC色譜圖

2.2.2 混合對照品溶液的制備 分別稱取干燥至恒重的淫羊藿苷和丹參酮ⅡA對照品5.0 mg和2.0 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含淫羊藿苷0.10 mg和丹參酮ⅡA0.040 mg的混合對照品儲備液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，研細，精密稱定，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，混勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照品溶液的制備 按本品處方工藝制備，取除淫羊藿和丹參外的陰性樣品，按照“2.2.3”項下方法處理，制備陰性對照溶液。

2.2.5 方法學考察

2.2.5.1 標準曲線的制備 取“2.2.2”項下的混合對照品溶液進行倍比稀釋，配制成不同濃度的對照品溶液，按上述色譜條件，注入液相色譜儀中，測定各自峰面積。以2種對照品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，各自計算回歸方程。淫羊藿苷：Y= 2.19×105X- 26.43，r=0.999 8；丹參酮ⅡA：Y= 3.77×105X+ 36.82，r=0.999 8。結果表明，淫羊藿苷在10～50 μg/mL、丹參酮ⅡA在4～20 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.5.2 精密度試驗 取同一對照品溶液，按照上述色譜條件，連續(xù)重復進樣6次，計算各峰面積值的RSD值分別為淫羊藿苷1.12%、丹參酮ⅡA0.83%，結果表明精密度良好。

2.2.5.3 重復性試驗 取同一批樣品(批號：140217)，共6份，按照“2.2.3”項下方法處理，按照上述色譜條件分析，結果樣品中淫羊藿苷平均含量4.80 mg/g，RSD=1.77%；丹參酮ⅡA平均含量0.53 mg/g，RSD=0.86%。表明方法重復性良好。

2.2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品，按照“2.2.3”項下方法處理，分別在制備后0，2，4，8，12，24 h進樣，測定峰面積，考察峰面積變化情況。淫羊藿苷RSD為0.98%，丹參酮ⅡARSD為2.23%，表明2個成分至少在24 h內穩(wěn)定。

2.2.5.5 加樣回收率試驗 取已知淫羊藿和丹參酮ⅡA含量的同一批樣品(批號：140217)，共6份，約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入各對照品溶液適量，按照“2.2.3”項下方法處理，照上述色譜條件進行測定，計算淫羊藿苷和丹參酮ⅡA加樣回收率，結果見表1。

2.2.6 樣品含量測定 取不同批號樣品，按上述供試品溶液的制備方法和色譜條件進行含量測定，平行6份進樣分析。計算淫羊藿苷和丹參酮ⅡA的含量，結果見表2。

表1 2種成分回收率的測定結果

表2 淫羊藿和丹參酮ⅡA含量(n=3)

3 討論

骨質疏松癥是一種以低骨量和骨組織微結構破壞為特征，導致骨質脆性增加和易于骨折的代謝性骨病，常見于中老年人，且其發(fā)病率呈逐年增加的趨勢[4]。復方益節(jié)健片能夠明顯的提高骨密度，緩解骨痛，可用于預防骨質疏松癥。但目前，復方益節(jié)健片的質量標準尚未完善。因此，本文建立了復方益節(jié)健片的定性定量研究方法。

前期研究中已建立了復方益節(jié)健片中淫羊藿苷的含量測定，并確定了提取工藝為50%甲醇超聲提取30 min。本試驗中，考慮到丹參酮ⅡA的不穩(wěn)定性，為了更好地對淫羊藿苷和丹參酮ⅡA進行定量研究，對提取方法，提取溶劑，提取時間做了綜合的考量，最后確定采用甲醇超聲提取30 min。

在前期工作及相關文獻的基礎上[6]，曾考察甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)的不同梯度為流動相，并且調節(jié)不同的流速和柱溫。最后采用乙腈-水系統(tǒng)進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃。在此條件下，淫羊藿苷和丹參酮ⅡA樣品的相對保留時間分別在11.51 min和30.42 min，均達到基線分離的要求。綜上，本方法簡便可行、重復性好，適用于復方益節(jié)健片的質量控制。

[1]成魁,葛寶豐,甄平,等. 口服淫羊藿苷可提高大鼠的峰值骨密度和骨質量[J].中國骨質疏松雜志,2014,20(2):120-124.

[2]謝詩涓,李健,熊鶯. 丹參酮ⅡA對人股骨頭成骨細胞金屬蛋白酶表達的影響[J]. 中國骨質疏松雜志,2012,18(8):685-689.

[3]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典·一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[4]白莉萍. 阿侖膦酸鈉對糖尿病合并骨質疏松骨密度的作用[J]. 中國藥物與臨床,2014,14(7):991-993.

[5]楊洪元. 保元排毒丸中丹參酮ⅡA的含量測定及穩(wěn)定性研究[J]. 中醫(yī)學報,2013,28(12):1851-1853.

[6]李春. HPLC法測定肌瘤化消顆粒中淫羊藿苷和丹參酮ⅡA[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床,2014,29(7):742-744.

福建省科技廳高校產學合作重大項目(2013Y4005)。

徐偉(1975—)，男，副教授。E-mail:xwfjtcm@sina.com。

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2015-02- 10)編輯：曾文雪