★ 彭文虎 盧曉南 徐國良 嚴(yán)小軍 劉紅寧 尚廣彬

(1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)/江西省中醫(yī)病因生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004；2 .江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 南昌 330004)

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免疫性血小板減少癥大鼠模型骨髓基質(zhì)細(xì)胞和TPO的變化

★ 彭文虎1盧曉南2徐國良1嚴(yán)小軍1劉紅寧1尚廣彬1

(1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)/江西省中醫(yī)病因生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004；2 .江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 南昌 330004)

目的：通過建立免疫性血小板減少癥(ITP)大鼠模型，觀察其對(duì)血液中血小板生成素(TPO)和骨髓微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞的影響。方法：將18只SD大鼠依據(jù)外周血小板數(shù)量隨機(jī)均分為正常組、模型組，模型組大鼠于1、3、4、6、7、8天腹腔注射兔抗大鼠血小板血清(APS)，正常組大鼠注射相應(yīng)量的生理鹽水。觀察各組動(dòng)物外周血象的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行骨髓涂片，ELISA檢測(cè)血漿中TPO的含量，體外培養(yǎng)并觀察骨髓基質(zhì)細(xì)胞生長狀況。結(jié)果：與正常組比較，模型組動(dòng)物血小板數(shù)量、TPO含量均顯著下降(P<0.05)，骨髓涂片巨核細(xì)胞數(shù)目沒有明顯變化(P>0.05)，基質(zhì)細(xì)胞貼壁時(shí)間和貼壁率也顯著下降(P<0.05)。結(jié)論：免疫性血小板減少癥大鼠模型血小板數(shù)目降低可能與TPO含量和骨髓微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞生長狀況密切相關(guān)。

免疫性血小板減少癥；大鼠模型；骨髓基質(zhì)細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)研究

免疫性血小板減少癥是以血小板減少、血小板生存時(shí)間縮短及抗血小板自身抗體出現(xiàn)為特征的疾病，其發(fā)病原因未明，但已肯定的是它與血小板相關(guān)抗體(PAIgG)升高有關(guān)， PAIgG與血小板上相關(guān)抗原結(jié)合，導(dǎo)致血小板被破壞，引起血小板數(shù)量減少，出現(xiàn)紫癜、出血等癥狀。還可能是血小板生成不足引起的，血小板是由骨髓微環(huán)境中巨核細(xì)胞逐步生成并釋放到外周血中，其與骨髓微環(huán)境的狀況密切相關(guān)。自從蔣文明等[1]利用兔抗大鼠血小板血清建立血小板減少癥模型以來，關(guān)于治療血小板減少癥的藥效學(xué)研究大多基于大鼠或小鼠的這種模型進(jìn)行，但迄今為止很少有研究來揭示模型中APS對(duì)巨核細(xì)胞生成血小板周邊骨髓微環(huán)境的影響。本研究利用APS建立免疫性血小板減少癥模型并研究其對(duì)骨髓微環(huán)境主要組成成分——骨髓基質(zhì)細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 血小板生成素(TPO) ELISA試劑盒購自湖北優(yōu)爾生科技股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：L150115414,卡介苗購自佛山市南海百合醫(yī)療科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：00283，IMDM培養(yǎng)基購自SIGMA,生產(chǎn)批號(hào)：SLBH1594V，小牛血清購自浙江天杭科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：130203。全自動(dòng)動(dòng)物血細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞B(yǎng)C-2800 Vet)，臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠TDL-60B)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific Forma 3111),顯微鏡(日本奧林巴斯IX71),酶標(biāo)儀(美國MD公司Spectra Max Plus384)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，清潔級(jí)，體重 150～180g，雄性，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(湘)2013-0004。日本大耳兔，清潔級(jí)，2 kg，由南昌龍平兔業(yè)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(贛)2013-0001。

1.3 兔抗大鼠血小板血清(APS)的制備及檢測(cè) APS制備參考蔣文明等[1]做法，加以改進(jìn)。SD大鼠，戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，肝素抗凝，800 r/min離心15 min，取上層富含血小板血漿，3000 r/min離心10 min沉淀血小板。PBS洗滌血小板，調(diào)整血小板數(shù)至1×109個(gè)/L。將上述血小板懸液與等體積完全弗氏佐劑混合，制成完全弗氏佐劑抗原，在兔兩后肢足墊、腹部及背部進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射，每只注射佐劑抗原4 ml。首次注射后于1、2、4周，分別取上述相同濃度血小板懸液與不完全弗氏佐劑等體積混合制成不完全弗氏佐劑抗原，多點(diǎn)皮下注射增強(qiáng)免疫，每次每只4 ml。第5周，頸總動(dòng)脈取血，室溫放置1 h，3000 r/min離心20 min，分離血清。進(jìn)行紅細(xì)胞吸附后ELISA法檢測(cè)兔抗大鼠血小板血清的效價(jià)。

1.4 免疫性血小板減少大鼠模型制作及檢測(cè) 將18只150g左右的SD大鼠眼眶取血測(cè)其血小板后，根據(jù)其血小板數(shù)量將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組，每組9只。模型組的大鼠于1、3、4、6、7、8天按1ml/200g的量腹腔注射1:4稀釋的APS，正常對(duì)照組注射同體積的生理鹽水。停止注射APS后的第2天即造模第10天，將各組動(dòng)物眼眶靜脈取血作外周血象檢測(cè)，離心分離血漿按照ELISA說明書測(cè)定各組樣品中TPO的含量。

1.5 大鼠骨髓涂片 檢測(cè)外周血象后脫臼處死動(dòng)物，無菌條件下取出兩側(cè)的股骨，剝離干凈，用PBS將一根股骨中的骨髓沖出后涂片，分別過6號(hào)針頭，4號(hào)針頭，離心，取出100ul制成骨髓涂片，晾干，瑞氏-姬姆薩染色，觀察計(jì)算整張玻片骨髓巨核細(xì)胞數(shù)目

1.6 骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 剪去另一股骨兩端，IMDM 培養(yǎng)液沖出骨髓細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，以 1×107 個(gè)/ mL 接種在12孔板中，置于 5%,37℃，CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3、5天觀察其貼壁率情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及分析 采用Graphpad prism 5軟件，數(shù)據(jù)以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫性血小板減少大鼠造模前后血小板數(shù)目的變化 經(jīng)檢測(cè)制備的兔抗大鼠血小板血清(APS)ELISA效價(jià)隨著稀釋倍數(shù)的增大，OD值逐漸減小，效價(jià)逐漸降低。與陰性對(duì)照組相比較，APS稀釋512倍仍然大于陰性對(duì)照組的10倍。經(jīng)過注射APS造模后，血小板數(shù)目變化結(jié)果如表1所示：造模后的大鼠血小板數(shù)量降低明顯，幾乎是正常組和造模前的一半，有極顯著性差異(P<0.01)。

表1 各組大鼠造模前后血小板數(shù)目的比較(×109個(gè)/L，n=9)

2.2 血小板減少癥模型大鼠中巨核細(xì)胞數(shù)目的變化 造模后眼眶取血,確定血小板明顯降低(見表1) ,取各組動(dòng)物的股骨骨髓涂片,顯微鏡下統(tǒng)計(jì)大鼠骨髓巨核細(xì)胞數(shù)目,與正常組相比,模型組巨核細(xì)胞數(shù)目稍有下降,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 ASP對(duì)骨髓巨核細(xì)胞的影響 (n=9)

2.3 各組動(dòng)物血漿中TPO含量比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示：大鼠經(jīng)APS干預(yù)造模后其血漿中的TPO含量與正常組比較顯著減少，有顯著性意義(P<0.05)。

表3 各組動(dòng)物血漿中TPO含量 (n=9)

2.4 骨髓基質(zhì)細(xì)胞生長狀況 骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)24h后，細(xì)胞逐漸開始貼壁生長，以長梭形為主，偶見三角形、多角形等。培養(yǎng)3天、5天時(shí)骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁情況如表4所示：模型組基質(zhì)細(xì)胞貼壁率明顯比正常組要低得多 ，有顯著性差異(P<0.05)。

表4 各組動(dòng)物骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁率情況 (n=9)

3 討論

免疫性血小板減少癥是以全身皮下紫癜或內(nèi)臟黏膜出血為其臨床表現(xiàn)特征的一種出血性疾病[2]。它的發(fā)病機(jī)理不明，目前的研究主要集中在血小板破壞增加和生成減少兩個(gè)方面，都與血小板相關(guān)抗體密切相關(guān)，它與血小板上相關(guān)抗原結(jié)合破壞血小板，或與帶相同抗原的巨核細(xì)胞結(jié)合影響血小板形成，臨床表現(xiàn)為巨核細(xì)胞不變或增多，伴隨成熟分化障礙，血小板急劇下降[3]。本實(shí)驗(yàn)利用外源APS注射動(dòng)物，血小板數(shù)目極顯著降低(P<0.01)，同時(shí)巨核細(xì)胞數(shù)目基本沒有變化，巨核細(xì)胞成熟程度分類及所占比例可能發(fā)生了變化，這與免疫性血小板減少癥的臨床表現(xiàn)一致，說明模型成功建立。

血小板生成素(TPO)主要存在于肝、腎中，少量在脾和骨髓，1994年得到純化并被確定為巨核細(xì)胞分化、成熟和血小板生成的特異性調(diào)控因子，并影響血小板的功能。而在免疫性血小板減少癥中TPO含量方面，存在著很大爭(zhēng)議[4]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究認(rèn)為ITP患者[5]和動(dòng)物[6]的TPO濃度顯著高于正常對(duì)照組，可能是患者血小板生成明顯減少，血小板表面吸附的TPO減少，致使循環(huán)中TPO濃度升高。也有文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]ITP患者的血液TPO水平略低于對(duì)照組，其原因?yàn)镮TP血小板破壞而數(shù)量減少，巨核細(xì)胞增生卻成熟障礙，增多的巨核細(xì)胞吸附了循環(huán)中的TPO，維持血中TPO水平正常偏低，甚至更低，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致：模型組血漿中TPO顯著降低(P<0.05)。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞是骨髓內(nèi)包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種的總稱，其分泌的細(xì)胞因子、黏附分子、細(xì)胞外基質(zhì)等形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，構(gòu)成了造血微環(huán)境，在造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化，以及巨核細(xì)胞最終成熟釋放血小板均起到關(guān)鍵作用。例如分泌TPO、IL等促巨核細(xì)胞增殖、分化作用的細(xì)胞因子，因此骨髓微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞的生長狀況直接影響到巨核細(xì)胞及血小板的數(shù)量。通過注射APS可能會(huì)影響骨髓基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的微環(huán)境，造成巨核細(xì)胞成熟障礙，血小板降低。我們體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)也證明了這一推測(cè)：相同時(shí)間內(nèi)模型組大鼠基質(zhì)細(xì)胞的貼壁率明顯低于正常組(P<0.05)，但血小板相關(guān)抗體如何影響骨髓微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞，以及基質(zhì)細(xì)胞與巨核細(xì)胞增殖分化生成血小板的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260653)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20114BAB215039)；江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(GJJ13582)；江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(2013A006)。

尚廣彬，男，講師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。E-mail: shanggb107@126.com.

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2015-04- 25)編輯：王河寶