陽雪，曹曉光，龍琴

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院眼科，北京 100073；2.北京大學(xué)人民醫(yī)院眼科，北京 100044）

補體C3a促進人視網(wǎng)膜色素上皮細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子的研究

陽雪1，曹曉光2，龍琴1

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院眼科，北京 100073；2.北京大學(xué)人民醫(yī)院眼科，北京 100044）

目的觀察補體活化產(chǎn)物C3a對體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞（RPE）分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的影響。方法采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）和半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）的方法，測定濃度0.1 μmol/L和0.3 μmol/L的重組人C3a干預(yù)RPE細胞24、48、72 h后VEGF蛋白和mRNA表達水平。結(jié)果0.1 μmol/L的C3a干預(yù)RPE細胞72 h后，VEGF蛋白表達高于干預(yù)48 h和24 h的水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；0.3 μmol/L的C3a作用RPE細胞24、48、72 h后，VEGF蛋白表達組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），具有正性時間—效應(yīng)關(guān)系；0.1 μmol/L的C3a作用RPE細胞72 h后，VEGF mRNA表達高于48 h和24 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；0.3 μmol/L的C3a作用RPE細胞72 h后，VEGF mRNA表達高于48 h和24 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；0.3 μmol/L的C3a作用72 h時VEGF的蛋白表達量高于0.1 μmol/L的C3a，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；0.3 μmol/L的C3a作用24 h時VEGF mRNA表達量高于0.1 μmol/L的C3a，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論C3a可促進人RPE細胞VEGF的分泌，高濃度C3a對VEGF分泌的促進作用早于低濃度C3a，提示補體活化程度越強，對新生血管的促進作用則越迅速。

人視網(wǎng)膜色素上皮細胞；補體C3a；血管內(nèi)皮生長因子

近年來，補體在脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）發(fā)生過程中的作用受到越來越多的關(guān)注［1，2］。補體系統(tǒng)活化所產(chǎn)生的多種裂解片段，尤其是C3a，與靶細胞表面受體結(jié)合，釋放炎性介質(zhì)和細胞因子，成為補體依賴性反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。研究表明，在年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）患者的玻璃膜疣和小鼠CNV模型局部均可見C3a表達顯著升高［3，4］，抑制C3a或C3a受體功能則可減輕動物模型中CNV的發(fā)生［4］。視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）作為CNV啟動信號的產(chǎn)生者，可表達包括C3a在內(nèi)的多種補體受體，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為機體內(nèi)新生血管形成的強促進因子，在CNV的發(fā)生中起重要作用［5］，然而，C3a與VEGF的內(nèi)在效應(yīng)關(guān)系目前研究不足。因此，本研究擬通過觀察C3a刺激人RPE細胞中VEGF分泌的變化，探討C3a在CNV發(fā)生過程中可能存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。

1 材料與方法

1.1 RPE細胞培養(yǎng)

人RPE細胞ARPE19細胞株由北京大學(xué)人民醫(yī)院眼科實驗室饋贈。RPE細胞培養(yǎng)參照文獻［6］。將凍存的RPE細胞復(fù)蘇后，置于37℃、5%CO2、濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用含15%胎牛血清的DMEM+Ham′s F12培養(yǎng)基（F12）（1∶1）。當(dāng)細胞接近融合時，用0.25%胰酶+0.02%EDTA進行傳代。將生長良好的自復(fù)蘇開始傳代3次的RPE細胞計數(shù)后以4×105/孔的細胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h細胞達到70%融合后，用含2 mmol/mL谷氨酰胺的無血清培養(yǎng)基替換含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液進行干預(yù)實驗。

1.2 C3a干預(yù)實驗

采用重組人C3a（204881，Millipore公司，美國）進行RPE干預(yù)實驗，培養(yǎng)基為無血清DMEM+F12培養(yǎng)基。實驗組：RPE細胞培養(yǎng)液中加入含終濃度分別為0.1和0.3 μmol/L的C3a；對照組：RPE細胞培養(yǎng)基中不加C3a（終濃度為0 μmol/L）。培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，分別收集細胞上清液1 mL，置于-80℃保存待用，每種C3a濃度和時間點設(shè)4個平行孔。

1.3 RPE細胞分泌蛋白水平的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法進行RPE細胞的VEGF蛋白分泌量檢測。參照VEGF試劑盒（ExCell Biology Inc.公司，中國上海）說明書進行操作。將各孔數(shù)值與其相同時間下空白對照孔數(shù)值的比值代表蛋白表達進行統(tǒng)計分析。

1.4 RPE細胞分泌mRNA水平的檢測

采用0.2 μmol/L C3a刺激RPE細胞48 h，以0 μmol/L C3a作為對照。收集各孔細胞，Trizol法提取細胞總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR），2%瓊脂糖凝膠電泳，同時設(shè)立空白對照和GAPDH為內(nèi)參照。應(yīng)用凝膠圖像處理系統(tǒng)進行條帶灰度分析，VEGF和PEDF的灰度值與同一樣品GAPDH的灰度值的比值代表其mRNA的表達參與統(tǒng)計分析。VEGF上游引物：5′TGCATTCACATTTG TTGTGCTGTAG 3′，下游引物5′GCAGATTATGCGG ATCAAACC 3′；GAPDH上游引物：5′TCACCATCT TCCAGGAGCGAG 3′，下游引物：5′TGTCGCTGTTG AAGTCAGAG 3′。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 11.5和GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析，總體差異比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗。本研究測量指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料以表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C3a作用下RPE細胞刺激VEGF分泌的時間—效應(yīng)關(guān)系

2.1.1 VEGF蛋白水平：濃度為0.1 μmol/L的C3a分別作用24 h、48 h、72 h后，各個時間點RPE細胞VEGF蛋白表達的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.56，P＜0.05），經(jīng)組間比較發(fā)現(xiàn)，作用48 h與24 h VEGF蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異（q=1.69，P＞0.05），作用72 h后VEGF蛋白表達分別是48 h和24 h的1.13倍和1.22倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（72 h vs 48 h：q= 3.34，P＜0.05；72 h vs 24 h：q=5.03，P＜0.01）。濃度為0.3 μmol/L的C3a分別作用24 h、48 h、72 h后，各個時間點RPE細胞VEGF蛋白表達的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=86.20，P＜0.01），經(jīng)組間比較發(fā)現(xiàn)，作用24 h、48 h、72 h VEGF蛋白表達組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（24 h vs 48 h：q=9.38，P＜0.01；24 h vs 72 h：q=18.57，P＜0.01；48 h vs 72 h：q=9.19，P＜0.01），作用72 h后VEGF蛋白表達分別是48 h和24 h的1.72倍和1.26倍。見表1，圖1。

2.1.2 VEGF核酸水平（RT-PCR）：濃度為0.1 μmol/L的C3a分別作用24 h、48 h、72 h后，各個時間點VEGF mRNA表達的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.89，P＜0.01），經(jīng)組間比較發(fā)現(xiàn)，作用48 h與24 h后VEGF mRNA表達無統(tǒng)計學(xué)差異（q=2.34，P＞0.05），作用72 h后VEGF mRNA表達分別是48 h和24 h的1.13倍和1.22倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（72 h vs 48 h：q=4.17，P＜0.05；72 h vs 24 h：q=6.51，P＜0.01）。濃度為0.3 μmol/L的C3a分別作用24 h、48 h、72 h后，各個時間點RPE細胞VEGF mRNA表達的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.49，P＜0.01），經(jīng)組間比較發(fā)現(xiàn)，48 h與24 h VEGF mRNA表達無統(tǒng)計學(xué)差異（q=0.40，P＞0.05），作用72 h后VEGF mRNA表達分別是48 h和24 h的1.23倍和1.25倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（72 h vs 48 h：q=7.24，P＜0.01；72 h vs 24h：q=7.64，P＜0.01）。見表2，圖2。

表1 不同濃度C3a作用下VEGF蛋白表達水平Tab.1 Protein level of VEGF affected by C3a at different concentrations and time points

圖1 C3a作用下RPE細胞分泌VEGF蛋白水平Fig.1 Protein level of VEGF affected by C3a at different concentrations and time points

2.2 C3a干預(yù)RPE細胞分泌VEGF的劑量-效應(yīng)關(guān)系

ELISA結(jié)果顯示：0.1 μmol/L與0.3 μmol/L的C3a作用24 h、48 h后，VEGF的蛋白表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異（24 h：t=2.28，P＞0.05；48 h：t=1.59，P＞0.05），而0.3 μmol/L的C3a作用72 h后VEGF蛋白表達水平是0.1 μmol/L C3a作用下蛋白表達的1.20倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.57，P＜0.01）。RTPCR結(jié)果顯示：0.3 μmol/L C3a作用24 h后，VEGF mRNA表達水平是0.1 μmol/L C3a作用下的1.08倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.19，P＜0.01），而0.1 μmol/L與0.3 μmol/L C3a作用48 h和72 h后VEGF mRNA表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異（48 h：t=0.48，P＞0.05；72 h：t=7.42，P＞0.05）。

表2 不同濃度C3a作用下VEGF mRNA表達水平Tab.2 mRNA level of VEGF affected by C3a at different concentrations and time points

圖2 C3a作用下RPE細胞分泌VEGF mRNA水平Fig.2 mRNA level of VEGF affected by C3a at different concentrations and time points

3 討論

CNV是眼內(nèi)新生血管的重要表現(xiàn)形式之一，常累及黃斑，造成出血、滲出和瘢痕形成，嚴(yán)重影響視功能，因此成為包括AMD、病理性近視、息肉樣脈絡(luò)膜血管病變等眼部疾病的主要致盲原因［7～9］。CNV形成的確切機制目前尚不清楚，其病理生理變化包括細胞外基質(zhì)降解、血管內(nèi)皮細胞增生和毛細血管管腔形成等過程，RPE細胞、巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞以及VEGF等促血管生長因子和色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）等抑血管生長因子共同參與和調(diào)控CNV的發(fā)生發(fā)展［10］。臨床研究和動物實驗顯示，眼內(nèi)拮抗VEGF可有效地減輕CNV的發(fā)生［11，12］。CNV的發(fā)生原因除缺氧因素外，組織學(xué)研究證實，在CNV膜上及其周圍存在著補體成分表達升高，補體系統(tǒng)活化的中間產(chǎn)物C3和VEGF的變化具有相同的趨勢［13］。因此，補體系統(tǒng)的活化成為CNV發(fā)生發(fā)展的另一病理生理基礎(chǔ)。C3a作為補體系統(tǒng)活化過程中最重要的補體成分之一，對CNV形成必然起到不可忽視的作用。

本研究結(jié)果提示，一定濃度C3a干預(yù)可增加RPE細胞VEGF蛋白的分泌，向有利于新生血管生長的方向變化，與相關(guān)研究報道呈現(xiàn)相似的趨勢［4］。從時間-效應(yīng)關(guān)系分析，在相同濃度C3a刺激下，增加刺激時間可增加VEGF的蛋白分泌，其中低濃度C3a（0.1 μmol/L）需要刺激RPE細胞72 h后VEGF的升高才可達到統(tǒng)計學(xué)意義，而高濃度C3a（0.3 μmol/L）刺激48 h后VEGF即可顯著升高，提示以C3a為標(biāo)志的補體活化程度越強，對新生血管生成因子VEGF的促進作用則越迅速；從劑量-效應(yīng)關(guān)系分析，在相同刺激時間下，增加C3a濃度后，VEGF的蛋白分泌具有升高的趨勢。mRNA水平的檢測結(jié)果顯示了同樣的變化，進一步提示補體活化對RPE細胞所參與的新生血管生成的促進作用。然而，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，蛋白水平的變化和mRNA水平的變化并不完全同步，0.3 μmol/L C3a作用24 h后，VEGF mRNA表達水平顯著增加，但并不伴有VEGF蛋白水平的增加，其原因可能與VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄后翻譯延遲，或其他細胞因子（如PEDF）和轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor β，TGF-β）等的相互作用有關(guān)。

此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在無C3a作用下，RPE細胞本身可分泌一定量的VEGF（數(shù)據(jù)未顯示），這一生理現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在既往和相關(guān)研究中［5，6］。VEGF的基礎(chǔ)分泌不僅對于維持脈絡(luò)膜的營養(yǎng)具有重要意義，同時，以VEGF為代表的促血管生成因子和PEDF等抑血管生成因子的平衡參與并維持了新生血管形成的生理性調(diào)控作用。假設(shè)在缺氧或其他損傷作用下，補體系統(tǒng)活化后產(chǎn)生包括C3a在內(nèi)的活性因子，通過改變促血管生長因子和抑血管生長因子的生理平衡狀態(tài)，促進新生血管的生長，一方面啟動機體的損傷修復(fù)反應(yīng)，另一方面由于新生血管尚不完善的生理功能，出現(xiàn)早期的滲出、出血和晚期的瘢痕形成等病理反應(yīng)。因此，如何合理調(diào)控損傷修復(fù)過程，增加新生血管的正常生理功能，抑制其病理過程，對新生血管性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變的治療具有重要的臨床意義。

補體系統(tǒng)作為一個高度復(fù)雜的生物反應(yīng)體系，由30余種蛋白分子所組成，它們相互作用并被體內(nèi)存在的精細而復(fù)雜的機制所調(diào)控。C3a代表補體系統(tǒng)的活化狀態(tài)，不僅影響著VEGF等細胞因子的分泌，而且對于和CNV形成密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)的功能同樣起調(diào)控作用［14］。此外，上述細胞因子和蛋白酶通過影響其上游和下游物質(zhì)，如結(jié)締組織生長因子、TGF-β等，構(gòu)成CNV形成的級聯(lián)效應(yīng)系統(tǒng)。本研究初步驗證了C3a促進VEGF分泌的作用，進一步的研究將探討C3a作用下血管內(nèi)皮細胞的增生、遷移等變化，從而完善補體活化狀態(tài)對新生血管管腔形成的影響，為臨床CNV的靶分子治療提供新的靶點和相應(yīng)的理論依據(jù)。

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（編輯 王又冬）

C3a Stimulatesthe Secretion ofVEGF in Human Retinal Pigment Epithelial Cells

YANGXue1，CAOXiao-guang2，LONGQin1

（1.Department of Ophthalmology，Peking Union Medical College Hospital，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100730，China；2.Department of Ophthalmology，Peking University People′s Hospital，Beijing 100730，China）

Objective To investigate the effect of C3a on vascular endothelial growth factor（VEGF）secretion in cultured human retinal pigment epithelial cells（RPECs）.MethodsRPECs were cultured in the presence of C3a at different concentrations（0.1 μmol/L and 0.3 μmol/L）for 24 h，48 h and 72 h.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）and semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）were used to detect the protein and mRNA levels of VEGF.ResultsThe protein expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.1 μmol/L at the time of 72 h was higher than that of 48 h and 24 h（P＜0.05）.A positive correlation was indicated between the protein expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.3 μmol/L and the duration of this influence（P＜0.01）.The mRNA expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.1 μmol/L and 0.3 μmol/L at the time of 72 h was higher than that of 48 h and 24 h（P＜0.05），respectively. The protein expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.3 μmol/L was higher than that of 0.1 μmol/L at the time of 72 h（P＜0.01）.The mRNA expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.3 μmol/L was higher than that of 0.1 μmol/L at the time of 24 h（P＜0.01）.ConclusionC3a promotes the secretion of VEGF in RPECs in a concentration dependent manner，which indicates that the stronger the activation of complement is，the faster the promotion of neovascularization.

human retinal pigment epithelium cell；C3a；vascular endothelial growth factor

R774.1

A

0258-4646（2015）11-0966-05

國家自然科學(xué)基金（81070755）

陽雪（1990-），女，碩士研究生.

龍琴，E-mail：longqinbj@hotmail.com

2015-09-16

網(wǎng)絡(luò)出版時間：