黎橋，席克虎，桂巖，王有虎，張福宏，陳小婉，江英，侯赟，張小兵

（蘭州大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，蘭州 730000）

·論著·

18β?甘草次酸對變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜中水通道蛋白1和5表達(dá)的影響

黎橋，席克虎，桂巖，王有虎，張福宏，陳小婉，江英，侯赟，張小兵

（蘭州大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，蘭州 730000）

目的 觀察18β-甘草次酸對變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜水通道蛋白（AQP）表達(dá)的影響并探討其意義。方法將60只Wistar大鼠隨機(jī)均分為18β-甘草次酸組、氯雷他定組、模型組和正常對照組，18β-甘草次酸組、氯雷他定組及模型組大鼠經(jīng)卵清蛋白（OVA）致敏建立變應(yīng)性鼻炎疾病模型，造模成功后分別給藥干預(yù)，于給藥2、4、6、8、10周時，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法（SP法）檢測各組鼻黏膜中AQP1和AQP5的表達(dá)并進(jìn)行比較。結(jié)果AQP1和AQP5在各組大鼠鼻黏膜中分布相同，AQP1主要表達(dá)于上毛細(xì)血管、血竇內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞。AQP5強(qiáng)表達(dá)于腺上皮、導(dǎo)管上皮及黏膜上皮細(xì)胞的胞膜及胞質(zhì)。免疫組化染色統(tǒng)計學(xué)分析顯示，AQP1和AQP5在模型組的表達(dá)量顯著高于正常對照組（P＜0.05），在18β-甘草次酸組及氯雷他定組大鼠鼻黏膜中的表達(dá)量均隨給藥干預(yù)的時間延長逐漸下降，并接近于正常對照組。結(jié)論18β-甘草次酸可能通過下調(diào)AQP1和AQP5的表達(dá)緩解變應(yīng)性鼻炎撓鼻、噴嚏及流涕等癥狀。

18β-甘草次酸；水通道蛋白1；水通道蛋白5；變應(yīng)性鼻炎；免疫組織化學(xué)

甘草次酸（C30H46O4）是甘草在體內(nèi)經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶代謝后產(chǎn)生的主要有效成分，屬于五環(huán)三萜烯類化合物，可分為18β-甘草次酸（18β-glycyrrhetinic acid，18β-GA）及18α-甘草次酸2種光學(xué)異構(gòu)體。自然界18α-甘草次酸含量極少，目前的研究主要以18β-GA為主。研究表明，18β-GA具有抗炎［1］、抗腫瘤［2］、抗病毒［3］、抗過敏［4］等多種藥理作用。變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)，以黏膜水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張及腺體增生為基本病理改變，臨床癥狀主要表現(xiàn)為鼻塞、鼻癢及大量清涕，影響著全球10%～20%人的生活質(zhì)量和健康。水通道蛋白（aquaporin，AQP）是一類參與水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的特異性通道蛋白，與細(xì)胞內(nèi)外液體的轉(zhuǎn)運(yùn)及腺體的分泌密切相關(guān)。已有研究證明AQP廣泛分布于鼻黏膜組織，且在組織的水轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝異常過程中發(fā)揮重要作用［5］。18β-GA能通過調(diào)節(jié)免疫功能干預(yù)AR［6］，但其對AR鼻黏膜組織中AQP的影響鮮有報道。因此，本研究擬觀察18β-GA治療AR過程中對AQP1、AQP5的影響，探討18β-GA的干預(yù)作用與AQP的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試劑

卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美國Sigma公司，批號：1001445093），18β-GA（甘肅泛植生物科技有限公司，批號：12081603），氯雷他定（四川奧邦藥業(yè)有限公司，批號：121109）。兔抗大鼠AQP5購自英國Abcam公司，兔抗大鼠AQP1購自美國Sigma公司，兔SP檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及維持：無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級Wistar大鼠60只（甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF動物實(shí)驗(yàn)室提供），4～6周齡，體質(zhì)量180～220 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠隨機(jī)分成18β-GA組（n=15）、氯雷他定組（L組，n=15）、模型組（MC組，n=15）和正常對照組（NC組，n=15）。18β-GA組、L組及MC組大鼠經(jīng)OVA造模：首先基礎(chǔ)致敏，給予大鼠腹腔注射1 mL抗原佐劑混懸液［含0.3 mg OVA、30 mg AL（OH）3］進(jìn)行致敏，隔日1次，共7次，14 d。然后鼻腔激發(fā)，在末次腹腔注射基礎(chǔ)致敏后隔1日開始，用2%OVA溶液對實(shí)驗(yàn)組大鼠雙側(cè)鼻孔滴鼻，50 μL/側(cè)，1次/d，共7 d。每次鼻腔激發(fā)后即刻至30 min內(nèi)，觀察并記錄大鼠搔鼻動作次數(shù)、噴嚏個數(shù)及流涕情況，進(jìn)行癥狀學(xué)評分。NC組大鼠：以生理鹽水代替OVA，其余方法和步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。造模成功后，為了維持動物模型，18β-GA組、L組及MC組大鼠繼續(xù)給予2%OVA滴鼻，50 μL/側(cè)，2次/周，NC組大鼠以等量生理鹽水替代。1.2.2 大鼠行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)：每次鼻腔激發(fā)后即刻至30 min內(nèi)觀察并記錄大鼠鼻癢程度、噴嚏次數(shù)及流涕情況。疊加量化計分法記錄各組大鼠癥狀評分值，鼻癢程度：輕度撓鼻1～2次，記1分；抓撓鼻、面不止，到處摩擦記2分。噴嚏：1～3個為1分，4～10個為2分，11個以上為3分。流涕：流至前鼻孔為1分，超過前鼻孔為2分，流涕滿面為3分。各癥狀記分疊加，總分?jǐn)?shù)≥5分者為造模成功。

1.2.3 給藥方法：造模完成后，根據(jù)動物體表面積轉(zhuǎn)換計算公式，參考臨床氯雷他定膠囊及復(fù)方甘草酸苷片（日本米諾發(fā)源制藥株式會社，每片含甘草酸苷25 mg）用藥量進(jìn)行換算：L組大鼠給予氯雷他定（0.96 mg/kg溶于2 mL生理鹽水）灌胃，18β-GA組給予18β-GA（21.6 mg/kg溶于2 mL生理鹽水）灌胃，NC組和MC組以等量生理鹽水替代，1次/d。分別于給藥干預(yù)2、4、6、8、10周的末次給藥24 h后，隨機(jī)挑選每組3只大鼠，共計60只大鼠，給予10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，迅速取雙側(cè)鼻中隔黏膜，放入4℃的4%多聚甲醛溶液中固定，無水乙醇梯度脫水，石蠟包埋，4.5 μm厚連續(xù)切片。

1.2.4 免疫組化染色：采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（streptavidin-perosidase，SP）法，切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后，3%過氧化氫孵育15 min，PBS清洗3次，每次5 min。高壓抗原修復(fù)10 s。滴加山羊血清封閉液，室溫15 min，傾去直接滴加一抗AQP1多克隆抗體（1∶500）或AQP5多克隆抗體（1∶500），4℃，20 h。PBS清洗3次，每次5 min。加入生物素標(biāo)記二抗，室溫下孵育15 min，PBS清洗3次，每次5 min。加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，孵育15 min，3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

選擇背景清晰、染色清晰的切片做統(tǒng)計學(xué)分析，每只動物選取2個高倍視野。采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量大鼠鼻黏膜AQP1、AQP5表達(dá)的平均光密度值，所有數(shù)據(jù)均用表示。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，行單因素方差分析，比較兩兩差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠AR模型的建立

18β-GA組、L組及MC組大鼠（n=45）在末次鼻腔激發(fā)后均出現(xiàn)明顯外鼻紅腫、反復(fù)搔鼻、噴嚏不止及不同程度流涕，疊加評分均超過5分，說明AR模型造模成功。NC組大鼠僅有輕微的搔鼻、打噴嚏。MC組動物至實(shí)驗(yàn)完成時每日評分均＞5分；隨給藥時間延長，18β-GA組和L組外鼻紅脹程度逐漸減輕，噴嚏次數(shù)、搔鼻次數(shù)和鼻涕逐漸減少。

2.2 免疫組化染色定位、表達(dá)情況

光鏡下鼻黏膜組織中AQP1或5陽性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色，陰性對照不著色。MC組、NC組、L組、18β-GA組大鼠鼻黏膜中AQP1、AQP5分布一致，AQP1表達(dá)于鼻黏膜上皮下結(jié)締組織、毛細(xì)血管及血竇內(nèi)皮細(xì)胞，AQP5分布于鼻黏膜上皮細(xì)胞、腺上皮及導(dǎo)管上皮細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)。見圖1。

圖1 各組鼻黏膜AQP1和AQP5的陽性表達(dá) SP法×400Fig.1 Positive expression of AQP1，5 in the nasal mucosa of each group SP×400

AQP1的表達(dá)情況如表1所示。MC組：2、4、6、8、10周時，AQP1平均光密度值均明顯高于NC組（P＜0.05）。18β-GA組：2、4周時，AQP1平均光密度值略低于MC組，但仍高于NC組（P＜0.05）；6、8、10周時，該值持續(xù)下降，均顯著低于MC組（P＜0.05），接近于NC組。L組：2周時，AQP1的平均光密度值較MC組略低，但高于NC組（P＜0.05）；4、6、8、10周時，該值進(jìn)行性下降，明顯低于MC組（P＜0.05），與NC組無顯著差異。L組與18β-GA組各時間點(diǎn)AQP1平均光密度值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，18β-GA組及L組中AQP1的平均光密度值在第6、8、10周時與第2周時比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

表1 各組大鼠鼻黏膜AQP1表達(dá)的平均光密度值Tab.1 The mean optical density value of AQP1 expression in the nasal mucosa of each group

表1 各組大鼠鼻黏膜AQP1表達(dá)的平均光密度值Tab.1 The mean optical density value of AQP1 expression in the nasal mucosa of each group

1）P＜0.05 vs MC group；2）P＜0.05 vs NC group；3）P＜0.05 vs 2 weeks in the same group.

Week NC group MC group 18β-GA group L group 2 0.319 2±0.038 21） 0.444 2±0.029 9 0.413 6±0.043 82） 0.409 6±0.010 72）4 0.323 2±0.017 11） 0.452 9±0.030 3 0.393 9±0.050 72） 0.340 0±0.042 61）6 0.320 4±0.027 51） 0.457 1±0.015 5 0.365 7±0.039 21），3） 0.332 4±0.024 71），3）8 0.319 1±0.032 41） 0.461 5±0.018 9 0.339 8±0.447 41），3） 0.323 5±0.037 91），3）10 0.319 8±0.025 61） 0.459 8±0.029 5 0.330 2±0.013 81），3） 0.320 1±0.013 81），3）

AQP5的表達(dá)情況如表2所示：MC組的AQP5平均光密度值在各時間點(diǎn)均較NC組升高（P＜0.05）。18β-GA組：2、4周時，AQP5平均光密度值較MC組顯著下降（P＜0.05），但仍高于NC組（P＜0.05）；6、8、10周時，該值進(jìn)一步下降，顯著低于MC組（P＜0.05），并接近于NC組。L組：2周時，AQP5的平均光密度值略低于MC組，但高于NC組（P＜0.05）；4、 6、8、10周時，該值不斷下降，明顯低于MC組（P＜0.05），并接近于NC組。各時間點(diǎn)L組與18β-GA組AQP1平均光密度值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，18β-GA組AQP5的值在第10周時較第2周時明顯降低（P＜0.05），L組中AQP5值在第8、10周時較第2周時顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠鼻黏膜AQP5表達(dá)的平均光密度值Tab.2 The mean optical density value of AQP5 expression in the nasal mucosa of each group

表2 各組大鼠鼻黏膜AQP5表達(dá)的平均光密度值Tab.2 The mean optical density value of AQP5 expression in the nasal mucosa of each group

1）P＜0.05 vs MC group；2）P＜0.05 vs NC group；3）P＜0.05 vs 2 weeks in the same group.

Week NC group MC group 18β-GA group L group 2 0.483±0.0251） 0.590±0.022 0.581±0.0241），2） 0.546±0.0021）4 0.493±0.0201） 0.610±0.015 0.539±0.0351），2） 0.537±0.0091）6 0.500±0.0171） 0.586±0.025 0.532±0.0181），2） 0.524±0.0301）8 0.488±0.0301） 0.600±0.012 0.522±0.0131） 0.511±0.0051），3）10 0.494±0.0211） 0.592±0.019 0.515±0.0191），3） 0.511±0.0031），3）

3 討論

迄今為止，哺乳動物組織中至少發(fā)現(xiàn)了13種AQP，即AQP0～AQP12。AQP分布于人類機(jī)體所有的內(nèi)皮屏障組織及部分上皮屏障組織，與機(jī)體中液體的平衡及分泌緊密相關(guān)［7］，還可通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)一氧化氮調(diào)節(jié)血管舒張功能［8］。研究發(fā)現(xiàn)，喉癌及鼻息肉組織中AQP1表達(dá)升高且與血管內(nèi)皮生長因子水平呈顯著正相關(guān)［9，10］，而在缺乏AQP1的小鼠胸腔中滲透力明顯下降［11］，提示AQP1參與毛細(xì)血管的增生并提高其通透性。本研究中，通過免疫組化檢測觀察到AQP1在MC組呈更高水平表達(dá)，在干預(yù)第2、4、6、8及10周，AR組大鼠鼻黏膜AQP1表達(dá)水平均明顯高于NC組。而AQP1在變應(yīng)性鼻炎大鼠毛細(xì)血管內(nèi)皮和血竇內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)增強(qiáng)，提示其可能參與促進(jìn)毛細(xì)血管擴(kuò)張、提高毛細(xì)血管通透性、導(dǎo)致炎性細(xì)胞和液體滲出而引起局部炎性反應(yīng)及黏膜水腫；同時，AQP1在纖毛上皮細(xì)胞及基底細(xì)胞無表達(dá)，黏膜下滲出液轉(zhuǎn)運(yùn)顯著受抑，使液體聚集于組織間隙而進(jìn)一步加重黏膜水腫。

在人體中，AQP5主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、唾液腺、腮腺、汗腺上皮細(xì)胞上，對于這些組織和器官內(nèi)的水平衡起重要作用。Ma等［12］發(fā)現(xiàn)AQP5基因敲除后，小鼠胸膜、唾液腺及腮腺分泌液明顯減少。本研究采用免疫組織化學(xué)染色法觀察到在各觀測時間點(diǎn)，MC組AQP5表達(dá)水平均顯著高于NC組，提示腺上皮、導(dǎo)管上皮內(nèi)高度表達(dá)的AQP5可能參與促進(jìn)黏膜下漿液性腺、黏液腺增生及分泌，從而導(dǎo)致MC組大鼠出現(xiàn)大量清涕等表現(xiàn)。

氯雷他定是臨床治療變應(yīng)性鼻炎的一線藥物，屬于長效2代抗組胺藥，競爭性地抑制組胺H1受體，抑制組胺所引起的過敏癥狀。在臨床治療中，效果良好，相比1代抗組胺藥物，該藥無明顯的抗膽堿和中樞抑制作用。長期服用該藥可能出現(xiàn)頭痛、嗜睡、口干、視覺模糊、心悸、暈厥、運(yùn)動機(jī)能亢進(jìn)、黃疸、肝炎、肝壞死、脫發(fā)、癲癇發(fā)作、乳房腫大、多形性紅斑及全身性過敏反應(yīng)等不良反應(yīng)。本研究中，氯雷他定具有改善大鼠變應(yīng)性鼻炎的癥狀，下調(diào)變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜AQP1和AQP5表達(dá)的作用。而18β-GA對大鼠鼻黏膜癥狀改善及AQP1和AQP5的調(diào)節(jié)作用與氯雷他定無明顯差別，故認(rèn)為在變應(yīng)性疾病中，18β-GA可達(dá)到和氯雷他定相同的干預(yù)效果，均能通過下調(diào)變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜中AQP1和AQP5的表達(dá)，改善AR癥狀。但18β-GA的不良反應(yīng)還需進(jìn)一步研究。

甘草次酸又稱甘草亭酸，分子式為C30H46O4，其骨架11位上有C=O，類似18-H-齊墩果烷型結(jié)構(gòu)。因GA的分子構(gòu)像與類固醇激素相似，其物理特性、生物活性與類固醇激素也相類似，故其可作為配體與類固醇激素競爭性結(jié)合甾體激素的受體，還可與其代謝酶結(jié)合，從而產(chǎn)生多種多樣的生物學(xué)功效。甘草次酸通過下調(diào)11β-HSD活性從而阻止類固醇激素的失活代謝，使內(nèi)源性和外源性類固醇激素的血液濃度升高和半衰期延長［13］。甘草次酸在兔肝胞漿中與類固醇受體結(jié)合的抑制常數(shù)達(dá)1.7 nmol/L，即甘草次酸可以與類固醇激素受體相匹配，對激素引起下丘腦-垂體-腎上腺-受體系統(tǒng)抑制有拮抗作用，從而一定程度減少和減輕激素的某些副作用以及不良反應(yīng)［14］。單用甘草次酸時可出現(xiàn)輕度的激素樣作用，而與糖皮質(zhì)激素合用時，可有效提高激素的抗過敏反應(yīng)、抗炎和抗應(yīng)激反應(yīng)等效果，從而制造直接或間接的糖皮質(zhì)激素樣作用。暗示甘草次酸可能通過其糖皮質(zhì)激素樣作用干預(yù)AR疾病。

已有研究發(fā)現(xiàn)，18β-GA應(yīng)用于哮喘治療時，能顯著下調(diào)血清IgE、白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）、白細(xì)胞介素5（interleukin-5，IL-5）水平，抑制γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和IgG的降低，從而糾正Th1/Th2失衡［15］。Kroes等［16］認(rèn)為甘草次酸通過抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑而發(fā)揮抗炎作用，但對其旁路激活途徑無影響。本研究中，AR大鼠經(jīng)18β-GA干預(yù)后，外鼻紅脹程度逐漸減輕，噴嚏次數(shù)、搔鼻次數(shù)和鼻涕逐漸減少，鼻黏膜中AQP1和AQP5表達(dá)水平低于MC組，且隨干預(yù)時間的延長而逐漸下降并接近NC組。因此，推測18β-GA通過下調(diào)變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜中AQP1和AQP5的表達(dá)，減輕液體在組織間的潴留，抑制炎性細(xì)胞滲出及腺體分泌，改善AR癥狀。

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（編輯 王又冬）

Effect of18β-glycyrrhetinic Acid on Aquaporin 1，5 Expression in the Nasal Mucosa of Rats with Allergic Rhinitis

LIQiao，XIKe-hu，GUIYan，WANGYou-hu，ZHANG Fu-hong，CHENXiao-wan，JIANGYing，HOUYun，ZHANGXiao-bing

（Department of Ear-Nose-Throat，The First Hospital Associated to the Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

Objective To investigate the influence and its significance of 18β-glycyrrhetinic acid on the expression of aquaqporin 1，5（AQP1，5）in rat nasal mucosa with allergic rhinitis（AR）.MethodsSixty Wistar rats were randomly divided into four groups：model control group，loratadine group，18β-glycyrrhetinic acid group and normal control group.Rats in model control group，loratadine group and 18β-glycyrrhetinic acid group were first induced for allergic rhinitis by dripping ovalbumin，and then were treated respectively.After 2 weeks，4 weeks，6 weeks，8 weeks and 10 weeks，the expression of AQP1，5 in the nasal mucosa of each group was investigated and compared by immunohisto chemical technique.ResultsThe distribution of AQP1，5 was consistentin allgroups.AQP lexpressed mainly in capillary and blood sinus endothelial cells，and fibrocytes.AQP5 expressed intensively in the membrane and cytoplasm of the epithelium in the glands，cilia，and ductal epithelial area.The statistical analysis of immunohistochemical staining showed that the quantity of AQP1，5 in model group was significantly higher than that in normal group（P＜0.05），and with the extension of drug intervention time，the expression of AQP1，5 in loratadine group and 18β-glycyrrhetinic acid group were gradually decreased and almost equivalent to normal group.Conclusion18β-glycyrrhetinic may relieve symptoms of AR by down-regulating the expression of AQP1，5.

18-βglycyrrhetinic acid；aquaporin 1；aquaporin 5；allergic rhinitis；immunohistochemistry

R765.21

A

0258-4646（2015）11-0961-05

國家自然科學(xué)基金（81160449）；甘肅省衛(wèi)生廳行業(yè)科技計劃（GSWST2011-06）；甘肅省中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題（GZK-2011-22））

黎橋（1989-），女，碩士研究生.

張小兵，E-mail：790736924@qq.com

2014-12-29

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