金麗，周建麗，張曉丹，古卓良，卜瑩

(南京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所，南京 210002)

高效液相色譜手性流動相法測定鹽酸腎上腺素注射液中S-對映體含量

金麗，周建麗，張曉丹，古卓良，卜瑩

(南京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所，南京 210002)

目的 建立腎上腺素光學異構體中S-對映體的高效液相色譜手性流動相檢測方法。方法 Purospher?STAR RP-18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：10 mmol·L-1磷酸二氫鈉緩沖液(含10 mmol·L-1手性添加劑磺丁基-β-環(huán)糊精，磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-乙腈(98.5：1.5)，流速0.8 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長280 nm。結果 腎上腺素S-對映體在濃度5.02～501.50 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系，相關系數(shù)0.999 7，檢測限0.05 μg·mL-1。結論 該方法重復性、耐用性好，適用于鹽酸腎上腺素注射液中S-對映體雜質(zhì)含量的測定。

腎上腺素注射液，鹽酸；色譜法，高效液相；手性流動相；添加劑；S-對映體

腎上腺素為腎上腺素受體激動藥，對β1和β2受體均有較強的興奮作用，臨床主要用于心搏驟停、支氣管哮喘、過敏性休克，也可用于治療蕁麻疹、枯草熱及鼻黏膜或牙齦出血等[1]。鹽酸腎上腺素注射液是腎上腺素的主要劑型，為《中華人民共和國藥典》(2010年版)收載品種。此外，《美國藥典》(USP35)、《英國藥典》(BP2010)和《日本藥局方》(JP15)中也均有收載。腎上腺素為鄰苯二酚結構，結構中有一個手性碳原子，所以有兩個手性對映體，即R-對映體和S-對映體，二者與腎上腺素受體的親和力和內(nèi)在活性有明顯的差異，R-對映體對血管的收縮作用比S-對映體強十幾倍[2]。因此，各國藥典均采用腎上腺素R-對映體。但腎上腺素在合成過程中可能由于拆分不完全而殘留S-對映體；同時隨著貯藏時間的延長，注射液中的腎上腺素在也會發(fā)生消旋化反應而產(chǎn)生S-對映體，這都會導致腎上腺素的藥理活性下降[3]。因此，有必要對鹽酸腎上腺素注射液中S-對映體的含量加以控制。目前，腎上腺素對映體的拆分以毛細管電泳法和高效液相色譜法為主[3-5]，但研究多側重于腎上腺素消旋體的拆分方法，僅金微等[6]報道毛細管電泳法對不同鹽酸腎上腺素注射液中S-對映體含量的測定。筆者針對基層檢驗單位的實際情況，采用應用更廣的高效液相色譜法以含有手性添加劑流動相測定鹽酸腎上腺素注射液中S-對映體的含量，并對國內(nèi)7個廠家的101批次產(chǎn)品的S-對映體含量進行分析考察，以期為鹽酸腎上腺素注射液的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100 型高效液相色譜儀：包括二元泵、光電二極管陣列檢測器、Chem Station 色譜數(shù)據(jù)工作站(美國安捷倫公司)；PHS-3C型酸度計(上海精密儀器廠)；MS105電子天平、AL104電子天平(Mettler Toledo)。

1.2 試藥 鹽酸腎上腺素(鹽酸腎上腺素R-對映體)注射液(來自國內(nèi)7個廠家，共101批次，規(guī)格：1 mg：1 mL)；鹽酸腎上腺素消旋體(R，S-對映體)(Sigma-Aldrich公司，批號：SLBG5626V，純度以100%計)；腎上腺素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100154-201104，純度：99.7%)；磺丁基-β-環(huán)糊精(SBE-β-CD，西亞試劑公司，批號：F2503，純度：98%)；磷酸、磷酸二氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉、鹽酸均為分析純，乙腈為色譜純，水為新制重蒸水。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 系統(tǒng)適用性溶液 稱取鹽酸腎上腺素消旋體適量(相當于腎上腺素消旋體10 mg)，精密稱定，置10 mL量瓶中，加水適量使溶解并定容，搖勻，即得。

2.1.2 腎上腺素對照品溶液 稱取腎上腺素對照品(R-對映體)約10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加稀鹽酸1 mL使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液 取規(guī)格為1 mg：1 mL的鹽酸腎上腺素注射液直接測定。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Purospher?STAR RP-18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：10 mmol·L-1磷酸二氫鈉緩沖液(含10 mmol·L-1磺丁基-β-環(huán)糊精，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-乙腈(98.5：1.5)；流速0.8 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm；進樣量10 μL。

2.2.2 系統(tǒng)適用性 在上述色譜條件下，腎上腺素R-對映體和S-對映體分離度良好(Rs>1.9)，理論板數(shù)按R-對映體計>9 000，見圖1。

2.3 線性關系考察 精密稱取鹽酸腎上腺素消旋體120.3 mg(相當于腎上腺素消旋體100.3 mg)置100 mL量瓶中，加水適量使溶解，并定容，搖勻，制成1.003 mg·mL-1腎上腺素消旋體貯備液。分別精密量取儲備液1，2，4，10，20，40 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得梯度濃度分別為5.02，10.03，20.06，50.15，100.30，200.60，501.50 μg·mL-1的腎上腺素S-對映體溶液。采用“2.2.1”項色譜條件測定，記錄色譜圖。以色譜圖中腎上腺素S-對映體的峰面積(A)對其濃度(C)進行線性回歸，得線性方程和相關系數(shù)分別為：A=13.351C-26.876，R2=0.999 7。腎上腺素S-對映體在濃度5.02～501.50 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系，適合于低濃度范圍S-對映體雜質(zhì)的檢測。

2.4 檢測限 精密量取“2.3”項腎上腺素消旋體貯備液逐級定量稀釋，進樣并記錄色譜圖，按信噪比(S/N)為3計算檢測限。S-對映體的最低檢測濃度為0.05 μg·mL-1。

2.5 重復性與穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液按“2.2.1”項色譜條件重復測定6次，按歸一化法計算供試品中腎上腺素S-對映體的平均含量為1.51%，RSD為0.25%。結果表明該方法的重復性良好。取供試品溶液按“2.2.1”項色譜條件在0，4，8，12，24 h測定，按面積歸一化法計算供試品中腎上腺素S-對映體含量的RSD為0.98%。結果表明供試品溶液在24 h內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

Fig.1 Chromatograms of(±)epinephrine hydrochloride(A)，epinephrine standard(B)and epinephrine hydrochloride injection(C)

2.6 耐用性考察 取供試品溶液按“2.2.1”項下色譜條件，再選擇Shim-pack VP-ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱測定S-對映體的含量，計算兩種色譜柱測得S-對映體含量的RSD為1.25%。結果表明該方法具有較好的耐用性。

2.7 樣品S-對映體含量的測定 對101批次鹽酸腎上腺素注射液按“2.2.1”項色譜條件逐批檢測，按面積歸一化法計算S-對映體的百分含量，結果見圖2。S-對映體的百分含量范圍為1.31%～9.15%。

圖2 7家企業(yè)101批次鹽酸腎上腺素注射液中S-對映體的百分含量

Fig.2 Percentage ofS-isomer in 101 batches of epinephrine hydrochloride injections from 7 manufacturers

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

3.1.1 手性添加劑濃度的優(yōu)化 手性添加劑的濃度是影響腎上腺素R、S-對映體分離的一個重要的因素，通過調(diào)整手性添加劑的濃度，可使R、S-對映體達到最佳分離。在乙腈-10 mmol·L-1的磷酸二氫鈉緩沖液中(用磷酸調(diào)節(jié)pH3.0)添加SBE-β-CD，使其濃度分別為2.5，5，10和20 mmol·L-1。實驗結果表明，在一定范圍內(nèi)，當SBE-β-CD濃度逐漸加大時，R、S-對映體的保留時間隨之增加，同時分離度隨之增大?？紤]到SBE-β-CD濃度過大對色譜柱損傷較大且流動相也更易霉變，故最終選擇10 mmol·L-1的SBE-β-CD作為手性添加劑的濃度。

3.1.2 緩沖液pH的優(yōu)化 用磷酸將含10 mmol·L-1SBE-β-CD的10 mmol·L-1磷酸二氫鈉緩沖液調(diào)至不同的pH：2.0，2.5，3.0，3.5，分離腎上腺素R、S-對映體。結果表明：在pH 2.0～3.5范圍內(nèi)，隨著pH的增大，R、S-對映體的保留時間呈增加趨勢，而分離度變化不明顯?？紤]pH較高時，R、S-對映體保留時間過長，本研究選擇pH3.0的10 mmol·L-1磷酸二氫鈉緩沖液(含10 mmol·L-1SBE-β-CD)-乙腈(98：5：1.5)為流動相。

3.2 樣品結果分析 101批次鹽酸腎上腺素注射液中均檢出S-對映體，含量為1.31%～9.15%。其中1家公司(簡稱為A公司)產(chǎn)品的S-對映體的含量均>6%(n=25)，1家公司(簡稱為B公司)產(chǎn)品的S-對映體含量均<3%(n=27)。比較兩公司產(chǎn)品的pH發(fā)現(xiàn)，A公司的產(chǎn)品(pH均值為3.0，n=25)的pH低于B公司產(chǎn)品(pH均值為3.5，n=27)，表明產(chǎn)品pH與S-對映體的含量有一定的相關性。按“2.2.1”項下色譜條件測定不同pH值的模擬鹽酸腎上腺素注射液中S-對映體含量。結果pH在3.5～5.5之間，腎上腺素較為穩(wěn)定，在pH3.5以下和pH5.5以上腎上腺素的消旋化反應速度加快，pH2.5時制劑中S-對映體的含量明顯增加，說明注射液的pH值過高或過低都不利于腎上腺素的穩(wěn)定。

比較7家公司的處方組成與S-對映體含量的關系：抗氧劑焦亞硫酸鈉或亞硫酸鈉用量約為0.1%，且添加螯合劑EDTA的產(chǎn)品，各批次S-對映體含量均<3%；抗氧劑使用量正常，未添加螯合劑EDTA的產(chǎn)品，各批次S-對映體含量均>3%；抗氧劑使用量僅為0.03%，且添加螯合劑EDTA的A公司產(chǎn)品，各批次S-對映體含量均>6%。結果表明抗氧劑焦亞硫酸鈉(或亞硫酸鈉)和螯合劑EDTA有助于注射液中R-對映體的穩(wěn)定，對腎上腺素的消旋化有一定的抑制作用。

[1] 宋冬梅，任美婷，段更利.腎上腺素原料藥及鹽酸腎上腺素注射液雜質(zhì)的HPLC-QTOF MS分析[J].藥物分析雜志，2012，32(8)：1468-1470，1452.

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.026

Determination ofS-isomer in Epinephrine Hydrochloride Injection by HPLC with Chiral Mobile Phase Additives

JIN Li, ZHOU Jianli, ZHANG Xiaodan, GU Zhuoliang, BU Ying

(TheInstituteofQualityControlofMedicalMaterialandEquipmentundertheJointLogisticDepartmentofNanjingCommand,Nanjing210002,China)

Objective To establish a method for the chiral separation and determination ofS-isomer in epinephrine hydrochloride injection by HPLC with chiral mobile phase additives. Methods Column of Purospher?STAR RP-18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used.The mobile phase was acetonitrile-10 mmol·L-1sodium dihydrogen phosphate buffer containing 10 mmol·L-1sulfobutylether-β-cyclodextrin (pH adjusted to 3.0 with phosphoric acid) (98.5：1.5), detection wavelength was 280 nm, the flow rate was 0.8 mL·min-1, and the column temperature was 30 ℃. Results Good linear relationship was established between the peak area and the concentration ofS-isomer over the range of 5.02-1501.50 μg·mL-1(R2=0.999 7).The detection limit was 0.05 μg·mL-1. Conclusion The proposed method shows high repeatability and durability.It can be employed for the quality control ofS-isomer in epinephrine hydrochloride injection.

Epinephrine injection, hydrochloride；Chromatography, high performance liquid； Chiral mobile phase； Additives；S-isomer

2014-02-28

2014-07-21

金麗(1976-)，女，江西南昌人，副主任藥師，博士，研究方向：藥物分析。電話：025-80867152-8015，E-mail：mailjinli@sohu.com。

卜瑩(1978-)，女，江蘇揚州人，副主任藥師，碩士，研究方向：藥物分析。電話：025-80867169，E-mail：buyouyou@126.com。

R971.3；R927.2

A

1004-0781(2015)06-0799-03