周?chē)?guó)麗+鄭仕萍+楊曉紅郭雪+范源

摘要：目的 研究及分析在不同的pH溶液中，五倍子中沒(méi)食子酸、單寧酸、五沒(méi)食子酰基葡萄糖（β-PGG）的含量變化。方法 將五倍子粉末分別加入pH為4，4.5，5，5.5，6醋酸鹽緩沖液中，在95℃水浴條件下提取3.5 h，用反相高效液相色譜測(cè)定沒(méi)食子酸、單寧酸、β-PGG的含量。結(jié)果 當(dāng)pH等于4時(shí)，五倍子醋酸鹽緩沖液的沒(méi)食子酸含量最高；pH等于4.5時(shí)，單寧酸的含量最高；pH等于5.5時(shí)，β-PGG的含量最高。結(jié)論 在pH分別等于4、4.5、5.5的條件下，五倍子醋酸鹽緩沖液中的沒(méi)食子酸、單寧酸、β-PGG的含量最高。

關(guān)鍵詞：五倍子；醋酸鹽緩沖液；β-PGG；沒(méi)食子酸；單寧酸；HPLC；不同pH

中圖分類(lèi)號(hào)：P284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2014）12-0059-03

五倍子是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，《本草綱目》記載五倍子性酸、咸、平、無(wú)毒，能斂肺降火，化痰飲，止咳嗽、止渴等[1]。臨床研究表明五倍子具有清除自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒以及收斂等藥理作用。五倍子含有豐富的鞣質(zhì)成分，如β-PGG、沒(méi)食子酸、單寧酸等，通常這些活性成分的提取方法有溶劑提取法[2-5]、水解法[6]等。為了研究五倍子提取的新實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)用不同pH醋酸緩沖液，結(jié)合溶劑提取法提取五倍子中的β-PGG、沒(méi)食子酸、單寧酸，測(cè)定并分析其含量變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 干燥五倍子。乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），磷酸（分析純），醋酸（分析純），醋酸鈉，均購(gòu)自云南丹赤貿(mào)易有限公司，純凈水。β-PGG標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：14021908）、沒(méi)食子酸（購(gòu)自云南昆明中檢所，批號(hào)：110831-201204）、單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品（成都邁斯克醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：130721）。

1.2 儀器 DFY-600搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，D2KW-D電熱恒溫水浴鍋，Agilent1200型高效液相色譜儀（VWD檢測(cè)器），分析天平，酸度計(jì)（OHAUS/奧豪斯，型號(hào) STARTER 3100/F）。

1.3 方法

1.3.1 沒(méi)食子酸、單寧酸、β-PGG對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定沒(méi)食子酸對(duì)照品0.25 mg，置10 mL容量瓶中，加入50%甲醇制成25 mg/mL的溶液，備用。精密稱(chēng)取0.30 mg單寧酸對(duì)照品，用乙醇、水、丙酮體積比為69.9%、29.8%、0.3%的溶液溶解并定容，制備成濃度為30 ug/mL的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。精密稱(chēng)定β-PGG對(duì)照品0.25 mg，置10 mL容量瓶中，加入甲醇制成25 ug/mL的溶液，備用。

1.3.2 β-PGG、沒(méi)食子酸、單寧酸供試品溶液的制備 干燥五倍子粉碎，過(guò)80目篩，備用。精密稱(chēng)取5份五倍子粉末各約0.2 g分別置于250 mL帶塞錐形瓶中，分別精密加入醋酸鹽緩沖液40 mL，95℃水浴鍋中加熱水解3.5 h，冷卻，過(guò)濾。精密量取續(xù)濾液1.5 mL于10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，均搖，即得供試品溶液。

1.3.3 沒(méi)食子酸含量測(cè)定方法

1.3.3.1 沒(méi)食子酸色譜條件 色譜柱 C18柱（4.6×250 mm，5 um，Digma）；以甲醇-0.2%磷酸溶液（5∶ 95）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm；柱溫：25℃。

1.3.3.2 沒(méi)食子酸線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取對(duì)照品2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，用50%的甲醇溶解定容至刻度，搖勻作為儲(chǔ)備液。分別精密吸取0.1、0.5、1、2、4 mL于10 mL容量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即配制成濃度為1、5、10、20、40 ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣20 uL，以沒(méi)食子酸的峰面積（Y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（X）進(jìn)線性回歸，得方程y=114.7x+2.4554，r=0.9999，結(jié)果表明：沒(méi)食子酸峰面積值與濃度有良好的線性關(guān)系，線性范圍為1-10 ug/mL。

1.3.4 單寧酸含量測(cè)定方法

1.3.4.1 單寧酸色譜條件 C18柱（4.6×250 mm，5 um，Digma）；以甲醇-水（80∶ 20）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；柱溫：25℃。

1.3.4.2 單寧酸線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取對(duì)照品2.58 ug，置于10 mL容量瓶中，用乙醇、水、丙酮體積比為69.9、29.8、0.3%的溶液溶解并定容至刻度，搖勻作為儲(chǔ)備液。按上述單寧酸色譜條件分別取2、4、6、8、10 uL不同體積進(jìn)樣，以單寧酸的峰面積（Y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量（X）進(jìn)行線性回歸，得方程y=5719.5x-1924.8，r=0.9974，結(jié)果表明：?jiǎn)螌幩岱迕娣e值與質(zhì)量有良好的線性關(guān)系，線性范圍為0.516-2.58ug。

1.3.5 β-PGG含量測(cè)定方法

1.3.5.1 β-PGG色譜條件 色譜柱 C18柱（4.6×250 mm，5 um，Digma）；流動(dòng)相：0 min：乙腈-0.1%磷酸（10∶ 90），15 min：乙腈-0.1%磷酸（25∶ 75），15.1 min：乙腈-0.1%磷酸（25∶ 75），20 min：乙腈-0.1%磷酸（25∶ 75）；檢測(cè)波長(zhǎng)為281 nm；柱溫：25℃。

1.3.5.2 β-PGG線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取對(duì)照品8 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。從中精密吸取10 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述β-PGG色譜條件分別取2、4、6、8、10、15 uL不同體積進(jìn)樣，以β-PGG的峰面積（Y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量（X）進(jìn)行線性回歸，得方程y=2420237x-18.445，r=0.9998，結(jié)果表明：β-PGG峰面積值與質(zhì)量有良好的線性關(guān)系，線性范圍為0.139-1.0428ug。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 見(jiàn)表1。

2.2 結(jié)果分析 用pH=4；4.5；5；5.5；6的醋酸緩沖液提取五倍子中的沒(méi)食子酸，含量最高的是pH為4的緩沖液，見(jiàn)圖1。單寧酸含量最高的是pH為4.5的緩沖液，見(jiàn)圖2。β-PGG含量最高的是pH等于5.5的緩沖液，見(jiàn)圖3。而pH為6時(shí)，五倍子中沒(méi)食子酸、β-PGG、單寧酸的含量均最低。

五倍子單寧酸是一種易水解的多酚化合物，其能在酸性、堿性條件下水解產(chǎn)生沒(méi)食子酸、β-PGG等中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物之間存在相互轉(zhuǎn)化的可能，導(dǎo)致在不同的pH條件下，單寧酸、沒(méi)食子酸、β-PGG的含量均呈現(xiàn)相應(yīng)的變化。

3 結(jié)論

五倍子單寧酸的提取方法主要有溶劑提取法、超聲輔助提取法[7-10]、微波提取法[11-12]、加壓提取法[13]、超臨界CO2 萃取法[14]。沒(méi)食子酸的制備方法有酸水解法（常用硫酸）、堿水解法、發(fā)酵法、酶法。β-PGG的制備主要是醇解法[15-16]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HPLC法測(cè)定五倍子醋酸緩沖液在不同pH（4；4.5；5；5.5；6）條件下，其單寧酸、沒(méi)食子酸、β-PGG的含量變化，結(jié)果顯示pH等于4時(shí)，沒(méi)食子酸的含量最多。pH為5.5時(shí)，β-PGG的含量最多。pH為4.5時(shí)，單寧酸含量最高。而pH為6時(shí)，五倍子中沒(méi)食子酸、單寧酸、β-PGG的含量均最低，以上結(jié)果可能是沒(méi)食子酸、單寧酸、β-PGG在不同pH條件下穩(wěn)定性及水解機(jī)制不同所致。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用醋酸緩沖液提取五倍子中的有效成分，得出了提取沒(méi)食子酸、單寧酸、β-PGG的較適pH值，可為研究五倍子的制藥工藝、質(zhì)量控制及五倍子開(kāi)發(fā)利用提供一定參考。

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