馮國光，陳 峰，丁新德，朱松明，高 銘，顧志相

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院，上海 202150)

大腸癌局部微環(huán)境中細(xì)胞免疫功能狀況與預(yù)后的關(guān)系

馮國光，陳 峰，丁新德，朱松明，高 銘，顧志相

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院，上海 202150)

目的 探討大腸癌根治術(shù)后患者細(xì)胞免疫功能狀況與預(yù)后的關(guān)系。方法 取146例大腸癌患者手術(shù)切除標(biāo)本石蠟塊。采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測腫瘤、瘤旁1 cm和瘤旁8～10 cm腸壁組織(正常腸壁組織)中CD3+、CD4+、CD8+、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、樹突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)和轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白P3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Foxp3+Tregs)水平，采用Kaplan-Meier和Cox回歸分析評估這些指標(biāo)對預(yù)后的影響。結(jié)果 腫瘤組織中CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞和Foxp3+Tregs表達量顯著高于瘤旁1 cm組織及正常腸壁組織(P均<0.05)； 腫瘤組織中CD8+、NK細(xì)胞和DC細(xì)胞高表達組T3、T4期和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)均顯著低于低表達組(P均<0.05)；腫瘤組織中Foxp3+Tregs高表達組高TNM分期、術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和死亡例數(shù)均顯著高于低表達組(P均<0.05)；腫瘤組織內(nèi)Foxp3+Tregs高表達與TNM高分期和差的預(yù)后有顯著關(guān)系(P均<0.05)，并且是術(shù)后的一個獨立預(yù)后因素。結(jié)論 腫瘤組織中Foxp3+Tregs表達量與大腸癌根治術(shù)后患者預(yù)后密切相關(guān)，腫瘤組織中Foxp3+Tregs高表達是大腸癌根治術(shù)患者預(yù)后的一個獨立危險因素。

大腸癌；細(xì)胞免疫；Foxp3+Tregs；預(yù)后

正常情況下，在腫瘤形成前機體免疫系統(tǒng)可通過細(xì)胞免疫特異性殺滅引發(fā)腫瘤的突變細(xì)胞，而免疫系統(tǒng)缺陷、宿主對腫瘤抗原缺乏反應(yīng)是惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素。大腸癌是臨床常見腫瘤，多采取根治術(shù)治療，但根治術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的重要原因。惡性腫瘤局部免疫微環(huán)境與預(yù)后有著密切的關(guān)系，其中腫瘤浸潤調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(tumor-infiltrating regulatory T cells，Tregs)可能起著重要作用。本研究探討了大腸癌局部免疫微環(huán)境與預(yù)后的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2007年1月—2008年12月在上海新華醫(yī)院崇明分院經(jīng)病理證實的146例首次大腸癌根治手術(shù)患者標(biāo)本，其中男79例，女67例；年齡42～81歲，平均65歲?；颊哔Y料完整，無自身免疫性疾病史，無化療、放療、生物及免疫治療史。所有手術(shù)基本由同一個手術(shù)團隊完成，保證手術(shù)質(zhì)量的一致性。腫瘤部位：結(jié)腸94例(盲腸12例，升結(jié)腸及肝曲18例，橫結(jié)腸例9例，降結(jié)腸及脾曲13例，乙結(jié)腸42例)，直腸52例。腫瘤直徑1.5～12 cm，平均2.7 cm。手術(shù)方式：右半結(jié)腸切除30例，橫結(jié)腸切除9例，左半結(jié)腸切除13例，乙狀結(jié)腸切除42例，直腸經(jīng)腹切除47例，經(jīng)腹會陰聯(lián)合切除5例。組織病理學(xué)分類、腫瘤浸潤深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期見表1。生存期從手術(shù)日計算，終止日期為死亡日或末次隨訪日，所有病例隨訪截止日期為2013年12月31日。隨訪結(jié)果：局部復(fù)發(fā)8例(5.5%)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移28例(19.2%)，與術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的死亡36例，總的5年生存率為75.3%(110/146)。

1.2 研究方法 分別用不同的單克隆抗體對CD3+、CD4+、CD8+、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、樹突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)和轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白P3+Tregs(Foxp3+Tregs)進行免疫組化染色，采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測各種免疫細(xì)胞在大腸癌患者腫瘤、瘤旁1 cm和瘤旁8～10 cm腸壁組織(正常腸壁組織)中的表達量，分析各種免疫細(xì)胞間的關(guān)系及與患者臨床病理和預(yù)后的關(guān)系。免疫細(xì)胞參數(shù)變量按中位數(shù)分為高表達組和低表達組。鼠抗人CD3(MAB-0030，克隆號：PS1)、鼠抗人CD4(MAB-0251，克隆號：4B12)、兔抗人CD8(RMA-0514，克隆號：SP16)、B細(xì)胞鼠抗人CD20 (MAB-0020，克隆號：L26)、NK細(xì)胞鼠抗人CD57(MAB-0257，克隆號：NK1)、DC細(xì)胞兔抗人S-100(RAB-0150) 來自Maixin-Bio(邁新生物)。Foxp3+Treg抗體：affinity purified anti human Foxp3(目錄號：85-14-4776-80，克隆號：PCH101)來自eBioscience公司(Foxp3是人Treg特異性抗體)，二抗均來自Leica的標(biāo)準(zhǔn)試劑——Leica二抗套裝試劑，包括抗原修復(fù)液、脫蠟溶液、洗滌溶液等。采用Leica公司的全自動免疫組化染色一體機，免疫組化的所有步驟包括烤片、脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷、標(biāo)記一炕、標(biāo)記二抗、顯色直到復(fù)染都由Bond-Max自動完成。

表1 146例大腸癌病理組織學(xué)分類、腫瘤浸潤深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期 例

1.3 免疫細(xì)胞計數(shù) 在400倍顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞，判定標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞膜或細(xì)胞核呈紅色或棕色顆粒。利用電腦圖像采集系統(tǒng)，隨機選取5個高倍視野拍照，再用圖像分析軟件(NIH Image 1.46 bundled with 64-bit Java)計算陽性細(xì)胞數(shù)。由2位高年資病理科醫(yī)生雙盲交叉讀片，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，用t檢驗或四格表2檢驗進行組間數(shù)據(jù)比較；用Kaplan-Meier做各免疫參數(shù)變量與預(yù)后的關(guān)系分析；用Cox回歸模型做單因素和多因素與預(yù)后關(guān)系分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各種免疫細(xì)胞在大腸癌局部微環(huán)境中的分布 大腸癌腫瘤組織中CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞和Foxp3+Tregs表達量顯著高于瘤旁1 cm組織及正常大腸壁組織(P均<0.05)，而瘤旁1 cm組織與正常大腸壁組織間表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。腫瘤組織中B細(xì)胞表達量與瘤旁1 cm組織及正常大腸壁組織表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 大腸癌局部微環(huán)境各組織中免疫細(xì)胞檢測結(jié)果

注：①與腫瘤組織比較，P<0.05。

2.2 大腸癌腫瘤組織中CD8+、NK細(xì)胞和DC細(xì)胞與臨床病理特點的關(guān)系 大腸癌腫瘤組織中CD8+、NK細(xì)胞和DC細(xì)胞高表達組的T3、T4期和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)均顯著低于低表達組(P均<0.05)，但與患者術(shù)后生存情況無直接相關(guān)性。見表3。

2.3 大腸癌局部微環(huán)境各組織中Foxp3+Tregs細(xì)胞與臨床病理特點的關(guān)系 腫瘤組織中Foxp3+Tregs高表達組TNM分期、術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和死亡例數(shù)均顯著高于低表達組(P均<0.05)；腫瘤旁1 cm 和正常腸壁組織中Foxp3+Tregs表達與患者臨床病理特點無相關(guān)性，見表4。

2.4 大腸癌腫瘤組織中Foxp3+Tregs表達與預(yù)后的關(guān)系對患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期以及腫瘤局部各免疫參數(shù)做Cox單因素生存分析，結(jié)果顯示腫瘤組織中Foxp3+Tregs高表達與TNM高分期和差預(yù)后顯著相關(guān)(P均<0.05)，癌旁1 cm和正常腸壁組織內(nèi)各種免疫細(xì)胞表達量與大腸癌預(yù)后無顯著相關(guān)性，見表5。多因素分析亦顯示腫瘤組織中Foxp3+Tregs表達差異和TNM分期高低是大腸癌患者根治術(shù)后獨立預(yù)后因素，見表6。

表3 大腸癌腫瘤組織中CD8+、NK細(xì)胞和DC細(xì)胞與臨床病理特點的關(guān)系 例

注：①與低表達組比較，P<0.05。

表4 大腸癌局部微環(huán)境各組織中Foxp3+Tregs細(xì)胞與臨床病理特點的關(guān)系 例

注：①與腫瘤組織組中低表達組比較，P<0.05。

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和術(shù)后局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與機體免疫功能低下、腫瘤細(xì)胞逃逸了機體的免疫監(jiān)控有重要關(guān)系。而眾多免疫細(xì)胞在腫瘤局部聚集反映了全身免疫系統(tǒng)對局部腫瘤的免疫應(yīng)答。浸潤在腫瘤周圍的淋巴細(xì)胞不僅有效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞，而且還有大量的Tregs，主要是CD4+、CD25+T細(xì)胞。通常認(rèn)為腫瘤組織內(nèi)Tregs異常增高有以下3種機制：①腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)的刺激引起Tregs的活化、增殖；②腫瘤細(xì)胞分泌的趨化因子誘導(dǎo)Tregs聚集到腫瘤局部；③一些細(xì)胞因子的分泌和誘導(dǎo)。因此Tregs在腫瘤局部集聚是其發(fā)揮免疫抑制作用的基礎(chǔ)，而隨著抑制功能的發(fā)揮又進一步促進了Tregs的聚集。

本研究結(jié)果顯示，大腸癌腫瘤組織中CD8+、NK細(xì)胞和DC細(xì)胞表達量與腫瘤浸潤深度和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，但是與患者預(yù)后無顯著相關(guān)性，提示它們具有降低腫瘤浸潤深度及減少淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作用。其機制在于：首先惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在能力在于克隆大量異常蛋白，這些異常蛋白有助于轉(zhuǎn)移，但這些異常蛋白作為腫瘤相關(guān)抗原容易被免疫微環(huán)境內(nèi)原位免疫反應(yīng)破壞；其次高密度的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)通常意味著一個健康的免疫系統(tǒng)。在淋巴結(jié)內(nèi)發(fā)生的免疫反應(yīng)也可能發(fā)揮應(yīng)有的功能，對抗腫瘤細(xì)胞并將其排入淋巴結(jié)內(nèi)，而淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤負(fù)荷小于原發(fā)灶。因此，轉(zhuǎn)移灶更容易受到免疫反應(yīng)完全破壞[1]。既往的研究認(rèn)為，腫瘤局部TILs高浸潤預(yù)示著良好的預(yù)后[2-3]，但近年來隨著對TILs深入研究，尤其是發(fā)現(xiàn)大量具有免疫抑制和調(diào)節(jié)功能的Treg后，人們對TILs在腫瘤微環(huán)境的作用有了新的認(rèn)識。

表5 Cox單因素生存分析

表6 Cox多因素生存分析

Kim等[4]認(rèn)為，大腸癌腫瘤組織中Foxp3的表達與患者疾病的進展相關(guān)，而不是Tregs；但是大腸癌Foxp3表達與臨床相關(guān)性還沒有獲得詳細(xì)的評估。以往對一些實體腫瘤包括胰腺癌、肝癌的研究發(fā)現(xiàn)，高密度Foxp3+Tregs浸潤患者預(yù)后差[5-6]。本研究顯示，大腸癌腫瘤組織中Foxp3+Tregs表達量較正常腸壁組織顯著增多，它反映了在腫瘤位點，宿主與腫瘤之間的免疫狀況改變，而Foxp3+Tregs高表達者TNM分期較晚，預(yù)后也明顯差于低表達者，與文獻[7-11]報道的結(jié)果相同。

Xu等[10]對90例結(jié)腸腺癌的研究結(jié)果提示，F(xiàn)oxp3陽性癌細(xì)胞的出現(xiàn)與更差的預(yù)后相關(guān)，認(rèn)為癌巢中出現(xiàn)Tregs是結(jié)腸癌總生存率的一個獨立危險因素，而Foxp3陽性癌細(xì)胞也可能是影響預(yù)后的一個危險因素。但是也有研究認(rèn)為Foxp3+Tregs的絕對數(shù)量和大腸癌患者預(yù)后之間無顯著相關(guān)性[5]。甚至有研究認(rèn)為，高頻率的Foxp3+Tregs事實上可能與一個良好的而不是糟糕的預(yù)后相關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中Foxp3+Tregs表達量是大腸癌患者根治術(shù)后的一個獨立預(yù)后因素，與Grimmig等[11]觀點相同。通常有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)能抑制腫瘤細(xì)胞的潛在侵襲性，具有免疫抑制功能的Foxp3+Tregs則可能放任腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，這或許就是腫瘤內(nèi)Foxp3+Tregs高表達者根治術(shù)后易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后差的原因。筆者認(rèn)為Foxp3+Tregs主導(dǎo)了不良的免疫環(huán)境，在腫瘤進展時抵消了抗腫瘤的免疫反應(yīng)。此外，腫瘤細(xì)胞本身的Foxp3 表達也可能使它們逃避效應(yīng)T細(xì)胞的反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤生長發(fā)展[4]，因而對患者預(yù)后造成不良影響。Foxp3+Tregs作用機制主要是通過抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和活化，導(dǎo)致免疫抑制細(xì)胞因子如IL-10和TGF-β分泌到腫瘤微環(huán)境[11]，抑制CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用[13]，引起DC細(xì)胞的凋亡[14]等途徑影響效應(yīng)T細(xì)胞對腫瘤的免疫應(yīng)答。

本研究結(jié)果提示，大腸癌組織內(nèi)Foxp3+Tregs的表達狀況是大腸癌患者的獨立預(yù)后因素，為臨床提供了一條極具價值的思路：①術(shù)后腫瘤組織免疫組化檢測Foxp3+Tregs可輔助判斷大腸癌根治術(shù)后患者的預(yù)后。②通過利用和激發(fā)機體的免疫反應(yīng)來對抗、抑制和殺滅腫瘤細(xì)胞(即大腸癌的免疫治療)以改善患者的預(yù)后。目前對于腫瘤的免疫治療探索動物實驗居多，臨床研究正在加速開展。近年來在美國，樹突狀細(xì)胞治療性疫苗在惡性淋巴瘤、前列腺癌、胃癌等多個腫瘤的治療研究已進入最后的臨床試驗。在我國，大腸癌樹突狀細(xì)胞治療性疫苗已進入二期臨床研究。但是如何精確調(diào)控患者機體的免疫功能達到最大限度的治療效果，而又不會增加患者自身免疫性疾病的風(fēng)險，需要對Treg這類T淋巴細(xì)胞亞群的結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控機制做進一步深入研究。

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The relationship between the status of cellular immune function in local microenvironment and prognosis in patients with colorectal cancer

FENG Guoguang, CHEN Feng, DING Xinde, ZHU Songming, GAO Ming, GU Zhixiang

(Chongming Branch of Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 202150, China)

Objective It is to approach the relationship between the status of cellular immune function in local microenvironment and prognosis in patients with colorectal cancer. Methods Paraffin blocks of operation resection of colorectal cancer were obtained from 146 patients. The levels of CD3+, CD4+, CD8+, B cells, natural kill cells (NK), dendritic cells (DC) and the transcription factor forkhead box protein P3+ regulatory T cells (Foxp3+Tregs) in the tissues of tumor and the intestine wall adjacent to tumor tissues of 1 cm and 8 to 10 cm were detected by immunohistochemistry staining technique to evaluate the relationship on prognostic effects by Kaplan-Meier and Cox regression analysis. Results The intratumoral CD3+, CD4+, CD8+, NK cells, DC cells and Foxp3+ Tregs counts were significantly higher than those in peritumoral 1 cm tissue and normal intestinal tissue (allP<0.05); The cases of T3, T4stage and regional lymph node metastasis in the intratumoral CD8+, NK and DC cells high counts group were significantly lower than those in the intratumoral CD8+, NK and DC cells low counts group (allP<0.05); the cases of T3, T4stage, recurrence and metastasis of tumor and deaths after operation in the intratumoral Foxp3+ Tregs high counts group were significantly higher than those in the intratumoral Foxp3+ Tregs low counts group (all P<0.05); the increased intratumoral Foxp3+ Tregs counts were associated with higher TNM stage and worse prognosis and was an independent prognostic factor for overall survival (allP< 0.05). Conclusion The intratumoral Foxp3+ Tregs counts are closely associated with the prognosis in patients with colorectal cancer after radical resection. The higher intratumoral Foxp3+ Tregs counts is an independent prognostic risk factor in patients with colorectal cancer after radical resection.

colorectal cancer; cellular immunity; Foxp3+ Tregs; prognosis

馮國光，男，主任醫(yī)師，研究方向為大腸癌的防治。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.21.007

R0735.34

A

1008-8849(2015)21-2299-04

2015-02-28