汪 猛，王麗娜，凌昌全

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)岳陽(yáng)臨床醫(yī)學(xué)院，上海 200437；2. 第二軍醫(yī)大學(xué),上海 200433)

綜 述

腺病毒介導(dǎo)的p53基因治療肝癌的基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展

汪 猛1，王麗娜2，凌昌全2

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)岳陽(yáng)臨床醫(yī)學(xué)院，上海 200437；2. 第二軍醫(yī)大學(xué),上海 200433)

腺病毒；p53；基因治療；肝癌；研究進(jìn)展

p53蛋白基因的失活在腫瘤形成過(guò)程中起著重要作用，是具有明確抑癌作用的基因，目前對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的研究較為透徹。研究發(fā)現(xiàn)P53蛋白不僅在細(xì)胞核內(nèi)能抑制腫瘤細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)中也能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[1]。有60%以上的腫瘤存在p53基因的異常(包括點(diǎn)突變、等位基因缺失、重排、插入、基因融合等)[2]。而在肝癌發(fā)病過(guò)程中，p53基因的異常更是普遍存在的，Kondo等[3]用復(fù)色熒光原位雜交法發(fā)現(xiàn)：58.8%的肝癌p53基因是缺失的。

目前，通過(guò)腺病毒介導(dǎo)將人正常p53基因?qū)肴梭w，去糾正p53基因的缺陷以發(fā)揮多種抗腫瘤治療作用，已作為一種治療方法開(kāi)始應(yīng)用于臨床。進(jìn)入人體之后，腺病毒會(huì)感染腫瘤靶細(xì)胞并把攜p53治療基因的腺病毒基因傳遞給細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，進(jìn)行p53基因的表達(dá)和翻譯，從而發(fā)揮其抑癌基因的功能[4]。2004年，腫瘤基因治療藥物“今又生”已作為世界第一個(gè)重組人p53腺病毒在中國(guó)上市，它由正常人腫瘤抑制基因p53和改構(gòu)5型腺病毒基因重組而成。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)Ad-p53治療方法已開(kāi)展了大量基礎(chǔ)與臨床研究，也包括對(duì)肝癌治療的研究。Ad-p53作為一種有效的基因治療制品，正逐漸發(fā)揮出重要的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)對(duì)Ad-p53治療肝癌的研究作一綜述。

1 基礎(chǔ)研究

1.1腺病毒介導(dǎo)的p53基因?qū)Ω伟┑囊种谱饔?/p>

1.1.1 Ad-p53能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖 張沁宏等[5]研究發(fā)現(xiàn)Ad-p53對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用呈濃度依賴性。當(dāng)Ad-p53在100MOI效靶比時(shí)，基本能完全抑制SMCC-7721細(xì)胞。感染2 d后P53蛋白表達(dá)達(dá)到高峰，SMCC-7721生長(zhǎng)受到明顯抑制。瘤內(nèi)注射Ad-p53后，荷瘤裸鼠的腫瘤體積明顯減小。Jong等[6]構(gòu)建rAd-p53來(lái)治療荷HuH7種植瘤裸鼠，結(jié)果表明，rAd-p53可以有效地治療p53突變的肝細(xì)胞癌。

1.1.2 多種Ad-p53給藥方式均具有明顯療效 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的復(fù)雜性還體現(xiàn)在Ad-p53給藥方式的多樣性。除以上提及的瘤內(nèi)注射給藥方式外，在進(jìn)行肝癌治療時(shí)，已有學(xué)者報(bào)道了經(jīng)動(dòng)物模型肝動(dòng)脈、門靜脈以及全身靜脈給藥的治療效果。有研究指出肝動(dòng)脈給藥效果優(yōu)于全身靜脈給藥，如Anderson等[7]設(shè)計(jì)了經(jīng)肝動(dòng)脈注射rAd-p53治療肝臟腫瘤的方案，用攜突變型p53基因的肝癌細(xì)胞株MCA-RH7777構(gòu)建同系鼠肝癌模型，肝動(dòng)脈給予制品，結(jié)果腫瘤的生長(zhǎng)受到明顯抑制，與全身靜脈給藥相比，提高了腫瘤組織轉(zhuǎn)基因表達(dá)，減少了全身暴露，顯示出肝動(dòng)脈途徑傳遞rAd-p53的可行性。Okimoto等[8]的研究采用肝動(dòng)脈、門靜脈注射AdCMV-p53治療RCN-9結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移荷瘤鼠，結(jié)果顯示，經(jīng)門靜脈組腫瘤大小為(43.7±6.9)mm，大于經(jīng)肝動(dòng)脈組(16.0±4.9)mm，但小于陰性對(duì)照組(88.2±6.7)mm，也說(shuō)明經(jīng)肝動(dòng)脈途徑給藥治療效果優(yōu)于門靜脈途徑，但門靜脈途徑也對(duì)腫瘤有部分抑制效應(yīng)，并且實(shí)驗(yàn)中同時(shí)應(yīng)用順鉑(CDDP，3 mg/kg)行腹腔注射，也未導(dǎo)致肝功能受損，進(jìn)一步表明門脈途徑的安全性。

1.1.3 Ad-p53可以提高放療、化療的敏感性，協(xié)同治療肝癌 放療、化療是肝癌的重要治療方法，研究發(fā)現(xiàn)Ad-p53還可通過(guò)提高肝癌細(xì)胞對(duì)放療、化療的敏感性增強(qiáng)抑癌作用。

1.1.3.1 Ad-p53可以提高肝癌細(xì)胞對(duì)放療敏感性 張沁宏等[9]以rAd-p53分別感染突變型p53肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5和野生型p53肝癌細(xì)胞SMMC-7721，發(fā)現(xiàn)rAd-p53能顯著抑制人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并提高細(xì)胞的放射敏感性，其對(duì)PLC/PRF/5細(xì)胞作用顯著強(qiáng)于SMMC-7721細(xì)胞；表明不同內(nèi)源性p53狀態(tài)的肝癌細(xì)胞對(duì)rAd-p53治療及其協(xié)同的放療敏感性可能不同。

1.1.3.2 Ad-p53能夠提高肝癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性 梁云等[10]采用p53基因型不同的三種人肝癌細(xì)胞株HepG2(部分wt-p53)、Hep3B(p53-/+)和PLC/PRF/5(mt-p53)，觀察攜帶wt-p53基因的重組腺病毒聯(lián)合化療藥物爭(zhēng)光霉素、絲裂霉素或甲氨蝶呤對(duì)肝細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，結(jié)果顯示wt-p53基因能提高肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。王征旭等[11]也通過(guò)構(gòu)建含人野生型p53抑癌基因的重組腺病毒載體，導(dǎo)入肝癌細(xì)胞系HepG2后，分別用光鏡、電鏡、Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生和在裸鼠體內(nèi)的成瘤性改變。發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞HepG2導(dǎo)入野生型p53抑癌基因后，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，并對(duì)化療藥物順鉑的敏感性明顯增加，且其生長(zhǎng)受到一定程度的抑制，在裸鼠體內(nèi)的成瘤性也降低。

1.1.4 Ad-p53可以聯(lián)合中醫(yī)藥治療肝癌 得力生注射液臨床用于中晚期原發(fā)性肝癌氣虛瘀滯證，消癌平臨床用于食管癌、胃癌、肺癌，對(duì)大腸癌、宮頸癌、白血病等多種惡性腫瘤亦有一定療效，亦可配合放療、化療及手術(shù)后治療。張開(kāi)通等[12]通過(guò)腹腔注射建立昆明小鼠H22肝癌腹水瘤模型，發(fā)現(xiàn)Ad-p53、得力生和消癌平均抑制H22細(xì)胞生長(zhǎng)并減少腹水形成，Ad-p53與中藥得力生、消癌平聯(lián)合腹腔內(nèi)給藥對(duì)治療腹水瘤有協(xié)同作用。

1.2 腺病毒介導(dǎo)的p53基因?qū)Ω伟┮种谱饔玫臋C(jī)制 現(xiàn)已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了Ad-p53可通過(guò)多種生物學(xué)途徑抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。其中針對(duì)肝癌，也有一些學(xué)者對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了探索。

Ad-p53主要通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡和周期阻滯從而起到抑制肝癌生長(zhǎng)的作用。研究發(fā)現(xiàn)其機(jī)制與多種細(xì)胞因子的蛋白和基因的表達(dá)有關(guān)。Reister等[13]報(bào)道肝癌細(xì)胞感染Ad-p53后，P53蛋白在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，并伴有p21基因和Bax基因表達(dá)增強(qiáng)，CD95基因表達(dá)上調(diào)，可能是Ad-p53感染使細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。郭英等[14]報(bào)道通過(guò)表達(dá)wt-p53的重組腺病毒載體，將p53基因?qū)敫伟┘?xì)胞株中，可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的明顯抑制，促使細(xì)胞凋亡，并使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。瘤內(nèi)注射Ad-p53后移植瘤生長(zhǎng)明顯受抑制，并出現(xiàn)瘤組織中P53和P21蛋白表達(dá)的上調(diào)。張沁宏等[5]也通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)證實(shí)Ad-p53感染SMCC-7721細(xì)胞后48 h可高表達(dá)P53蛋白，到第5天尚可檢測(cè)到弱表達(dá)的p53，Western blot法檢測(cè)到經(jīng)注射Ad-p53的腫瘤組織中可見(jiàn)P53蛋白的高表達(dá)。曲波等[15]通過(guò)在昆明鼠后肢股部皮下接種Hep-A-22肝癌細(xì)胞懸液建立動(dòng)物模型，其中治療組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于荷瘤局部皮下注射介導(dǎo)野生型p53基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒液，后采用PCR-ELISA法定量檢測(cè)昆明鼠肝癌組織端粒酶活性及免疫組化法觀察肝癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腺病毒介導(dǎo)的wt-p53基因能夠顯著抑制肝癌的生長(zhǎng)，明顯降低端酶的活性表達(dá)，下調(diào)Bcl-2基因蛋白的生成。

2 臨床研究

臨床應(yīng)用過(guò)程中藥物的安全性和有效性是學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)，腫瘤基因治療的研究種目繁多，目前僅我國(guó)的腺病毒介導(dǎo)的p53基因治療制品“今又生”已經(jīng)正式上市。

2.1 Ad-p53治療肝癌的臨床用藥途徑多樣 有學(xué)者認(rèn)為首選途徑為瘤內(nèi)注射，其他給藥途徑也有經(jīng)動(dòng)脈、靜脈、膽管、腔內(nèi)等[16]。因Ad-p53采用無(wú)復(fù)制能力的腺病毒作為載體，體液具有對(duì)腺病毒的中和作用、存在p53抗體與P53蛋白的反應(yīng)等，靜脈給藥途徑會(huì)影響其療效。具代表性的是在超聲引導(dǎo)下行瘤內(nèi)注射，如貢雪灝等[17]為評(píng)價(jià)超聲引導(dǎo)下瘤體內(nèi)注射重組人p53腺病毒治療晚期難治性肝癌的臨床療效及超聲導(dǎo)入基因治療的臨床應(yīng)用價(jià)值，對(duì)57例晚期肝癌患者行超聲引導(dǎo)下瘤體內(nèi)注射重組人p53腺病毒(rAd-p53)。結(jié)果顯示，超聲引導(dǎo)瘤內(nèi)注射既能控制肝癌基因治療的靶向性，又能對(duì)基因藥物療效進(jìn)行影像學(xué)評(píng)估，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。除瘤內(nèi)注射，也有運(yùn)用其他途徑給藥的，如Habib等[18]用wt-p53-CMV-Ad制品治療319例無(wú)法手術(shù)切除的、攜突變型p53基因的肝癌患者采用肝動(dòng)脈灌注給藥。結(jié)果表明：腺病毒可成功介導(dǎo)p53基因在腫瘤細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

2.2 Ad-p53可結(jié)合放療、化療等協(xié)同治療肝癌 Ad-p53單獨(dú)運(yùn)用療效有限，臨床上主要是用于結(jié)合放療、化療、熱療，提高傳統(tǒng)治療的療效。

2.2.1 Ad-p53可與放療的聯(lián)合運(yùn)用 Yang等[19]通過(guò)研究評(píng)價(jià)rAd-p53與立體定向放療聯(lián)合運(yùn)用治療原發(fā)性肝癌的可行性和療效，發(fā)現(xiàn)立體定向放療組和聯(lián)合治療組的1年生存率分別為70.0%和90.0%，1年無(wú)病生存率分別為65%和85%，結(jié)果提示rAd-p53與立體定向放療聯(lián)合運(yùn)用比僅行立體定向放療更為安全、有效，這為無(wú)法手術(shù)或不愿手術(shù)的原發(fā)性肝癌患者提供了一個(gè)較好的局部療法選擇。

2.2.2 Ad-p53可與化療聯(lián)合運(yùn)用 Chen等[20]將48例晚期肝癌患者隨機(jī)分為2組，治療組30例、對(duì)照組18例，所有病例均經(jīng)右髂外動(dòng)脈入路皮下埋植藥盒系統(tǒng)，并根據(jù)造影表現(xiàn)決定灌注藥物的靶動(dòng)脈。治療組在靶動(dòng)脈灌注p53基因制品(今又生)加羥基喜樹(shù)堿，每周1次，連續(xù)3周為1個(gè)療程，30例患者分別接受1～8個(gè)療程的治療；對(duì)照組僅行肝動(dòng)脈灌注羥基喜樹(shù)堿。結(jié)果顯示，p53基因制品經(jīng)肝動(dòng)脈序貫輸注是安全的，能夠延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，聯(lián)合用藥能提高患者存活率。金豐等[21]通過(guò)回顧性分析358例肝癌患者，發(fā)現(xiàn)重組人Ad-p53注射液聯(lián)合放化療患者的中位生存時(shí)間為22個(gè)月，明顯優(yōu)于單獨(dú)立體定向放療患者的11個(gè)月。也有將其聯(lián)合TACE治療肝癌的，Guan等[22]采用 TACE、經(jīng)皮肝瘤體內(nèi)注入rAd-p53兩種方法治療150例中晚期肝細(xì)胞癌患者，其中采用經(jīng)皮肝瘤體內(nèi)注入rAd-p53后聯(lián)合TACE治療中晚期肝細(xì)胞癌，并與同期病情相當(dāng)?shù)闹型砥诟渭?xì)胞癌僅行TACE治療相比較，有效率分別為67.6%和51.2%，白細(xì)胞下降例數(shù)少，程度輕(P=0.003)；癌性疼痛減輕程度明顯(P=0.017)；治療后Karuafsky評(píng)分有顯著性差異(P=0.029)?？梢?jiàn)，經(jīng)皮肝瘤體內(nèi)注入rAd-p53后聯(lián)合 TACE治療肝細(xì)胞癌，增強(qiáng)了抗癌效果，改善了患者的生存質(zhì)量。

2.3 Ad-p53聯(lián)合中醫(yī)藥治療肝癌的臨床應(yīng)用 中醫(yī)藥在肝癌的防治中有著重要的作用，吳孟超院士指出，在放、化療時(shí)，服用中藥可減輕毒副反應(yīng)，提高臨床療效；對(duì)不能耐受放、化療的患者，服用中藥在起到一定抑癌作用的同時(shí)，對(duì)一些并發(fā)癥如黃疸、腹水、疼痛等也有一定的療效，尤其在改善患者生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期方面具有獨(dú)到之處[23]。

有學(xué)者嘗試將Ad-p53與中藥制劑聯(lián)合運(yùn)用，取得較好效果。史守良等[24]將40例原發(fā)性肝癌患者隨機(jī)分為聯(lián)合組20例和對(duì)照組20例，觀察了p53基因治療制品聯(lián)合中藥治療原發(fā)性肝癌的臨床療效，其中對(duì)照組給予速溶表柔比星聯(lián)合“今又生”處理，聯(lián)合組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上加用中藥艾迪注射液治療。聯(lián)合組治療6個(gè)月和1年的甲胎蛋白、癌胚抗原含量均低于對(duì)照組，肝功能好于對(duì)照組；治療后1年的肝內(nèi)腫瘤個(gè)數(shù)和大小均好于對(duì)照組；治療后1年聯(lián)合組Child-Pugh評(píng)分明顯低于對(duì)照組?？梢?jiàn)艾迪注射液聯(lián)合今又生治療原發(fā)性肝癌效果好，可增強(qiáng)p53基因治療的效果。梁杰安[25]臨床治療與觀察研究了重組人p53腺病毒注射液肝動(dòng)脈灌注療法介入對(duì)伴門脈癌栓肝癌的影響，研究組采用p53肝動(dòng)脈灌注、TACE、中醫(yī)藥配合的綜合治療方法，對(duì)照組僅采用TACE與中醫(yī)藥結(jié)合的治療方法，2組均于術(shù)后根據(jù)其肝癌類型(肝郁脾虛型、氣滯血瘀型、濕熱蘊(yùn)結(jié)型、濕瘀搏結(jié)型、肝腎陰虧型)辨證使用中藥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組術(shù)后隨訪生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而術(shù)后的并發(fā)癥發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示使用中藥介入對(duì)伴門脈癌栓患者實(shí)施p53灌注治療有利于降低患者并發(fā)癥發(fā)生率，減輕患者痛苦，此方法有利于提高TACE治療伴PVTT的原發(fā)性肝癌患者的遠(yuǎn)期療效。

3 展 望

肝癌的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，p53基因的突變或缺失在肝癌的發(fā)病過(guò)程中起著非常重要的作用。基因治療的發(fā)展開(kāi)拓了肝癌治療研究的途徑。

國(guó)內(nèi)外通過(guò)導(dǎo)入外源性p53治療肝癌的基礎(chǔ)研究、臨床研究都取得了很多進(jìn)展，且研究形式多樣、切合臨床實(shí)際。雖然目前該治療方式依然處于早期臨床試驗(yàn)階段，“今又生”也仍未有足夠的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)確證其抗癌效果，但諸多研究已經(jīng)顯示出這種療法的運(yùn)用潛力。

Roth[26]認(rèn)為，在臨床上，作為單一療法，瘤內(nèi)注射Ad-p53有很好的安全性，可使腫瘤縮小、生長(zhǎng)受抑；還可用于治療有耐藥性的腫瘤，或提高放療和化療的療效。p53轉(zhuǎn)基因的表達(dá)位于高水平，同時(shí)能激活p53途徑的其他基因。但是，其臨床運(yùn)用的不良反應(yīng)仍值得關(guān)注，Gerolami等[27]指出，腺病毒的注射能導(dǎo)致病毒顆粒及轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，釋放IL-6、IL-8、TNF-α等，產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)，從而在殺死癌細(xì)胞的過(guò)程中損傷正常的肝細(xì)胞，勢(shì)必導(dǎo)致患有肝炎、肝硬化患者的肝功能惡化，但在瘤內(nèi)、肝動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)低劑量給藥似乎有很好的耐受性。因此，Ad-p53還需更多的研究來(lái)降低其臨床運(yùn)用的不良反應(yīng)。

將Ad-p53與介入治療、放療、化療及手術(shù)等傳統(tǒng)治療方式綜合運(yùn)用于臨床，逐漸成為研究的熱點(diǎn)，但其提高肝癌臨床療效的作用仍缺少更高級(jí)別的循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。特別值得一提的是，將基因治療與中醫(yī)藥聯(lián)合運(yùn)用，無(wú)疑是中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌的一種新模式，但聯(lián)合應(yīng)用的劑量、時(shí)間、給藥途徑等問(wèn)題都有待更多的探索和研究。

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凌昌全，E-mail:lingchangquan@hotmail.com

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81303112)；國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金項(xiàng)目(J1103607)

2014-10-15