田甜車(chē)念聰龍建飛王蕾鄒海艷趙暉

·論 著·

大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠缺血半暗區(qū)神經(jīng)可塑性蛋白及神經(jīng)因子的表達(dá)☆

田甜*車(chē)念聰*龍建飛*王蕾*鄒海艷*趙暉*

目的觀察缺血半暗區(qū)神經(jīng)生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)因子和抑制因子的表達(dá)變化，探討微環(huán)境改變對(duì)神經(jīng)元軸突再生、突觸重建的影響。方法線栓法建立大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型，HE染色觀察腦組織病理改變；Western blot方法檢測(cè)軸突再生標(biāo)志蛋白生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(growth associated protein, GAP-43)及突觸可塑性蛋白突觸素(synaptophysin,SYN)的表達(dá)；Western blot方法檢測(cè)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素1(angiopoietin-1,Ang1)及抑制因子NogoA(neurite outgrowth inhibitor-A)、Nogo受體(Nogo receptor,NgR)、RhoA(ras homolog gene family member A)的表達(dá)。結(jié)果大腦中動(dòng)脈栓塞15 d大鼠缺血半暗區(qū)皮層神經(jīng)元數(shù)目低于假手術(shù)組(P＜0.01)，GAP-43表達(dá)較假手術(shù)組下調(diào)(P＜0.05)，神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子NogoA、NogoR、RhoA表達(dá)高于假手術(shù)組(均P＜0.05)；二組大鼠缺血半暗區(qū)皮層SYN及營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、VEGF、Ang1表達(dá)水平無(wú)明顯差異(均P＞0.05)。結(jié)論神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子分泌增多可能與大腦中動(dòng)脈栓塞導(dǎo)致缺血半暗區(qū)神經(jīng)元軸突再生障礙發(fā)生機(jī)制相關(guān)。

大腦中動(dòng)脈栓塞模型缺血半暗區(qū) 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 抑制因子

缺血性腦卒中為腦血管疾病中最為常見(jiàn)的臨床類(lèi)型[1]，其病灶由缺血中心區(qū)和周?chē)凸鄥^(qū)，即缺血半影區(qū)組成[2]。半暗帶區(qū)的損傷是可逆的，拯救半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)損傷神經(jīng)元軸突的延長(zhǎng)與神經(jīng)突觸的重塑是腦缺血臨床治療的主要目的[3]。越來(lái)越多的研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后不能有效再生除與成熟神經(jīng)元可塑性降低還與再生微環(huán)境關(guān)系密切[4]。本文通過(guò)觀察缺血半暗區(qū)神經(jīng)生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)因子及抑制相關(guān)因子的表達(dá)變化，分析再生微環(huán)境對(duì)神經(jīng)元軸突再生、突觸重建的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠25只，體質(zhì)量350～370 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施許可證號(hào)：SYXK(JING)2010-0020。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周后正式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)，動(dòng)物隨機(jī)分為中動(dòng)脈栓塞組(模型組)15只、假手術(shù)組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中動(dòng)脈栓塞大鼠模型制備[5]采用SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量350～370 g，線栓法復(fù)制大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。待大鼠麻醉清醒后即刻觀察其活動(dòng)狀態(tài)，術(shù)后出現(xiàn)明顯左側(cè)偏癱體征(不能完全伸展左前肢、行走時(shí)向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈者)納入實(shí)驗(yàn)對(duì)象。假手術(shù)組大鼠麻醉后，僅暴露頸內(nèi)外動(dòng)脈分支，不閉塞大腦中動(dòng)脈。

1.2.2 取材與標(biāo)本處理 各組隨機(jī)取5只動(dòng)物，4%多聚甲醛心內(nèi)灌注固定，待固定充分后，開(kāi)顱取腦，切取視交叉后4 mm組織塊，于4℃外固定1周后，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，用于HE染色、免疫組織化學(xué)染色使用。各組另取5只動(dòng)物，冰浴上分離腦組織，用于Western blot檢測(cè)。

1.2.3 HE染色檢測(cè)病理改變切片脫蠟,常規(guī)蘇木精-伊紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)改變。在半暗區(qū)頂葉皮層選取5個(gè)視野，利用NIS-Elem ents Basic Research圖像采集分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)缺血半暗區(qū)皮層神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 Western blot方法檢測(cè)樣品蛋白電泳分離，轉(zhuǎn)印到PVDF膜，放入5%脫脂奶粉封閉60 min，將膜與一抗GAP-43(EPITOMIC1：50000)、Synapto?physin(EPITOMICS 1：100000)、BDNF(Epitomics 1：10000)、VEGF(abcam 1：7000)、Ang-1(MILL?PORE 1:2000)、NogoA (abcam1：20000)、NogoR (MILLPORE 1：2000)、RhoA (Cell Signaling 1：2000)、β-tublin(康為1：50000)、GAPDH(康為1：10000)4℃孵育過(guò)夜；二抗(山羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶；Abcam公司1：20000)室溫孵育1 h；化學(xué)發(fā)光、顯影、定影、曝光，洗片。掃描膠片，Im?age J軟件分析特異性條帶，讀取條帶積分光密度值(IOD)。目的蛋白數(shù)值除以?xún)?nèi)參蛋白GAPDH、Tublin數(shù)值以校正誤差，所得結(jié)果代表目的蛋白相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的定量資料用（±s）表示，采用SPSS11.5執(zhí)行Independent-Samples T Test，進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)，若總體方差齊同采用雙側(cè)檢驗(yàn)比較組間差異，方差不齊采用單側(cè)檢驗(yàn)比較組間差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 中動(dòng)脈栓塞大鼠缺血半暗區(qū)皮層病理改變HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元密集，胞漿豐富，胞核居中染色清楚（見(jiàn)圖1A）。中動(dòng)脈栓塞后，缺血中心區(qū)神經(jīng)元大量變性壞死，缺血半暗區(qū)部分神經(jīng)元變性壞死，胞體皺縮，胞核不清，核染色質(zhì)固縮，嗜酸性增加見(jiàn)（圖1）。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，缺血半暗區(qū)頂葉皮層神經(jīng)元計(jì)數(shù)(21.86±6.47)較假手術(shù)組皮層神經(jīng)元(64.17±4.02)明顯減少(t=10.025，P＜0.01)。

2.2 中動(dòng)脈栓塞大鼠缺血半暗區(qū)皮層軸突再生標(biāo)志蛋白GAP-43及突觸可塑性蛋白SYN表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖2、表1所示。中動(dòng)脈栓塞15天大鼠缺血半暗區(qū)皮層GAP-43表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低(P＜0.05)，而SYN的表達(dá)較假手術(shù)組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.3 中動(dòng)脈栓塞大鼠缺血半暗區(qū)皮層神經(jīng)生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、VEGF、Ang1蛋白的表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖4、5所示。中動(dòng)脈栓塞15 d大鼠缺血半暗區(qū)皮層BDNF、VEGF、Ang1表達(dá)較假手術(shù)組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.4 中動(dòng)脈栓塞大鼠缺血半暗區(qū)皮層神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子NogoA、NgR、RhoA蛋白的表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖6、7所示。中動(dòng)脈栓塞15 d大鼠缺血半暗區(qū)皮層NogoA、NgR、RhoA蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。

3 討論

表1 中動(dòng)脈栓塞大鼠缺血半暗區(qū)皮層GAP-43、SYN表達(dá)(IOD比值)

表2 中動(dòng)脈栓塞大鼠缺血半暗區(qū)皮層BDNF、VEGF、Ang1表達(dá)(IOD比值)

表3 中動(dòng)脈栓塞大鼠缺血半暗區(qū)皮層NogoA、NgR、RhoA表達(dá)(IOD比值)

圖1 HE染色假手術(shù)組：A組，中動(dòng)脈栓塞模型組：B組(標(biāo)尺：50μm)圖中顯示，缺血半暗區(qū)頂葉皮層部分神經(jīng)元變性，細(xì)胞皺縮，核染色質(zhì)固縮

圖2 Western blot檢測(cè)GAP-43、SYN表達(dá) 內(nèi)參蛋白GAPDH為對(duì)照

圖4 Western blot檢測(cè)BDNF、VEGF、Ang-1表達(dá) 內(nèi)參蛋白GAP?DH、Tublin為對(duì)照

圖6 Western blot檢測(cè)NogoA、NgR、RhoA表達(dá) 內(nèi)參蛋白Tublin為對(duì)照

神經(jīng)可塑性是腦功能康復(fù)的重要基礎(chǔ)，神經(jīng)元突起再生過(guò)程中合成的結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)軸突的生長(zhǎng)、新突觸形成及功能完善具有明顯的調(diào)控作用，是影響神經(jīng)元再生的內(nèi)在因素。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(growth associated protein，GAP-43)是一種特異性分布于生長(zhǎng)錐和突觸前膜上的磷酸蛋白，作為軸突再生的標(biāo)記蛋白，在引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)、神經(jīng)元細(xì)胞骨架的重新裝配及維持突觸功能等方面起著重要作用[6]。突觸素(synaptophysin,Syn)是突觸囊泡膜上的鈣結(jié)合蛋白，是神經(jīng)出芽的特異性分子標(biāo)志物[7]與突觸重建關(guān)系密切[8]。研究顯示，腦缺血后，軸索損傷，軸突在失去靶器官后,會(huì)出現(xiàn)發(fā)芽,形成許多側(cè)支，突觸前囊泡數(shù)量增加，如果軸突末梢在缺血半暗區(qū)未找到靶器官，其生長(zhǎng)自動(dòng)停止，則突觸前囊泡數(shù)量下降，因此在神經(jīng)損傷修復(fù)過(guò)程中，GAP-43、SYN的表達(dá)常常出現(xiàn)逐漸增加，隨后又降至正常水平的變化趨勢(shì)[9]。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們也注意到中動(dòng)脈栓塞第15天，大鼠缺血半暗區(qū)皮層SYN蛋白表達(dá)較假手術(shù)組無(wú)明顯增高。而GAP-43的蛋白表達(dá)較假手術(shù)組降低，結(jié)果表明，中樞神經(jīng)損傷后，機(jī)體內(nèi)源性修復(fù)能力有限，軸突再生困難，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[8-10]。

研究表明，中樞微環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)因子、抑制因子可相互作用，影響神經(jīng)元軸突的再生。Nogo蛋白(neurite outgrowth inhibitor)是中樞神經(jīng)再生抑制作用最強(qiáng)的物質(zhì)。相關(guān)研究表明，腦缺血所致神經(jīng)損傷可迅速誘導(dǎo)NogoA mRNA表達(dá)[11]。NogoA蛋白活性片段Nogo-66的細(xì)胞表面受體(Nogo recep?tor,NgR)，通過(guò)其N(xiāo)端功能區(qū)與NogoA特異性結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)RhoA-Rho激酶信號(hào)通路，引起神經(jīng)元生長(zhǎng)錐的潰變，抑制神經(jīng)軸突生長(zhǎng)[12]。

而腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived nerve raetor，BDNF)可通過(guò)提高cAMP水平，激活蛋白激酶A(protein kinase,PKA)，抑制RhoA(Ras homolog gene family,member A)信號(hào)通路，促進(jìn)軸突再生[13]。兩種血管生長(zhǎng)因子，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vscu?lar endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素(angiopoietin，Ang)相互協(xié)調(diào)[14]，對(duì)新生血管形成[15]，缺血腦區(qū)血液供應(yīng)及神經(jīng)元損傷后的修復(fù)具有重要的調(diào)節(jié)作用。

在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)中動(dòng)脈栓塞15天后，缺血半暗區(qū)神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子NogoA、NogoR、RhoA表達(dá)明顯增高，而營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、VEGF、Ang1表達(dá)較假手術(shù)組沒(méi)有明顯改變，提示，內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的修復(fù)作用有限，隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，半暗區(qū)神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子表達(dá)增加，可激活RhoA激酶信號(hào)，不利于神經(jīng)再生。已有大量研究顯示，藥物、針刺、康復(fù)訓(xùn)練可促進(jìn)神經(jīng)再生營(yíng)養(yǎng)因子分泌，拮抗軸突生長(zhǎng)抑制蛋白，促進(jìn)神經(jīng)再生[16-18]。腦缺血損傷的修復(fù)再生是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域迫切需要解決的難題，深入研究神經(jīng)生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)/抑制因子的表達(dá)變化，探討中藥、康復(fù)治療改善中樞微環(huán)境，提高內(nèi)源性修復(fù)能力的作用及機(jī)制，將為腦缺血疾病提供新的治療策略。

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（責(zé)任編輯:李立）

圖1 35歲男性患者，A，DSA顯示瘺口位于T9平面，引流靜脈迂曲走行；B，微導(dǎo)管到位后先行置入彈簧圈2個(gè)阻緩血流；C，術(shù)中注射Glubran膠并部分滲透至引流靜脈起始端將瘺口完全閉塞；D，術(shù)后造影示SDAVF完全閉塞

SDAVF年發(fā)病率為5-10/100萬(wàn)[3]，病因尚不明確，主要發(fā)病機(jī)制為脊髓靜脈高壓，其預(yù)后與患者術(shù)前病程長(zhǎng)短聯(lián)系緊密[4]。本病多見(jiàn)于中老年人，99%患者大于30歲，男性多發(fā)，瘺口分布常見(jiàn)于T6～L2[5]。本組病例與文獻(xiàn)報(bào)道相近。

SDAVF檢查方法主要有脊髓MR及DSA。脊髓MR可作為本病初篩檢查，脊髓DSA為診斷本病金標(biāo)準(zhǔn)，可以確定瘺口所在部位并清晰地顯示病變處的血管分布情況[1]。

SDAVF治療關(guān)鍵在于閉塞瘺口，主要有手術(shù)及介入栓塞治療。手術(shù)治療效果明確，極少?gòu)?fù)發(fā)。隨著栓塞材料的改進(jìn)，介入栓塞治療的復(fù)發(fā)率降低，且因其創(chuàng)傷小，術(shù)后無(wú)痛，住院周期短等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[6]?，F(xiàn)栓塞材料最常用為液態(tài)栓塞劑Glubran膠和Onyx膠。Glubran膠的優(yōu)點(diǎn)為栓塞作用持久，在使用膠時(shí)憑借微導(dǎo)管本身的占位作用部分/完全阻斷供血?jiǎng)用}，產(chǎn)生一個(gè)類(lèi)似“block”的效果，這樣既能控制血流，利用注射推力使Glubran向前推進(jìn)鑄形到達(dá)SDAVF引流靜脈起始端，又能防止Glubran膠逆流，以免造成正常血管誤栓，但因其為黏附性材料，可發(fā)生“黏管”，注射后必要立即撤管；Onyx膠優(yōu)點(diǎn)為不黏管，但有一定的潛在血管毒性。注射時(shí)要求Onyx膠圍繞導(dǎo)管頭端產(chǎn)生一個(gè)“block”，利用“等待”技巧提高Onyx的穿透力以更好地滲透進(jìn)入SDAVF引流靜脈起始端[7]。治療時(shí)栓塞劑彌散到引流靜脈起始端對(duì)于長(zhǎng)久栓塞效果的保持尤為重要，但要注意避免栓塞劑飄進(jìn)引流靜脈。瘺口引流靜脈有正常引流功能，一旦閉塞，脊髓靜脈引流障礙，加重脊髓靜脈高壓，患者臨床癥狀將難以改善甚至進(jìn)一步加重。

Nogueira等[8]應(yīng)用Onyx膠行介入栓塞治療時(shí)發(fā)現(xiàn)其可以很好進(jìn)入引流靜脈起始段并閉塞瘺口，然而B(niǎo)lack?burn等[9]發(fā)現(xiàn)NBCA較Onyx膠治療效果更為明確。本組用Onyx膠栓塞6例，Glubran膠栓塞7例，彈簧圈+Glubran膠栓塞1例，栓塞后即刻造影均提示瘺口成功栓塞，引流靜脈未見(jiàn)顯影，14例患者隨訪未見(jiàn)復(fù)發(fā)?；颊呓?jīng)血管內(nèi)栓塞治療術(shù)后改良Aminoff-Logue評(píng)分較術(shù)前減少，運(yùn)動(dòng)及排便功能術(shù)后未見(jiàn)病例加重。

綜上所述，血管內(nèi)栓塞治療SDAVF療效確切，其療效與患者術(shù)前病程長(zhǎng)短密切相關(guān)。

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【中圖分類(lèi)號(hào)】R651.2 (收稿日期：2014-11-04）

Neuronal plasticity and the changes of microenvironment at the ischemic neocortical penumbra after cere?bral artery occlusion in rats.

TIAN Tian,CHE Niancong,LONG Jianfei,WANG Lei,ZOU Haiyan,ZHAO Hui.School of Chinese Medicine,Capital Medical University,Beijing 100069,China.Tel:010-83950159.

ObjectivesTo investigate the effects of nerve nutrient factors and inhibitory factors on neuronal regen?eration and axonal reconstruction at ischemic neocortical penumbra after focal cerebral ischemia in rats.MethodsThe rat model of middle cerebral artery ischemia was established using suture-occluded method.The pathological morpholo?gy of brain tissue was examined by using HE staining.The expression levels of GAP-43 SYN,nutrient factor(BDNF VEGF Ang1)and inhibitory factor(NogoA NogoR RhoA)were determined by using Western blotting technique.ResultsThe number of neurons in ischemic penumbra was significantly decreased in model group(P＜0.01)than in sham-operat?ed group.The expression levels of GAP-43 were significantly decreased(P＜0.05)while the expression levels of NogoA NgR and RhoA in the thalamus were significantly increased(P＜0.05)in model group than in sham-operated group.The expression levels of SYN and nutrient factors(BDNF VEGF Ang1)were not different between the model group and sham-operated group.ConclusionThe increase in nerve inhibitory factors may contribute to the down-regulation of neu?rogenesis at ischemic neocortical penumbra after focal cerebral ischemia in rats.

Middle cerebral artery Ischemic penumbra Nutrient factor Inhibitory factor

R743.3

A

2014-07-02）

A （責(zé)任編輯:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.01.004

☆ 國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30973782，81473745）；北京市自然科學(xué)基金（編號(hào)：7122018）；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃-長(zhǎng)城學(xué)者項(xiàng)目（編號(hào)：CIT&TCD20140329）；北京市屬高等學(xué)校人才強(qiáng)教深化計(jì)劃“中青年骨干人材培養(yǎng)計(jì)劃”項(xiàng)目（編號(hào)：PXM-2011014226）

* 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院(北京100069)