田妮娜 ，封士蘭 ，周 麗

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅 蘭州 730000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定三顆針中4種生物堿類成分的含量

田妮娜1，2，封士蘭1，周 麗3

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅 蘭州 730000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

目的建立三顆針中小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺一測(cè)多評(píng)法，驗(yàn)證該方法的可行性和技術(shù)適應(yīng)性。方法 以小檗堿為指標(biāo)，計(jì)算巴馬汀、尖刺堿、小檗胺與小檗堿的相對(duì)校正因子，并用該校正因子進(jìn)行巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的含量計(jì)算，同時(shí)采用外標(biāo)法測(cè)定三顆針中該4種生物堿的含量，并比較外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法的結(jié)果，以驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性和可行性。結(jié)果 外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法的結(jié)果無顯著性差異（RSD＜5.0%）。結(jié)論 以一測(cè)多評(píng)法測(cè)定三顆針中小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的含量是準(zhǔn)確可行的。

一測(cè)多評(píng)法；三顆針；生物堿；外標(biāo)法

三顆針為常用中藥，是小檗科植物擬獠豬刺、小黃連刺、細(xì)葉小檗或匙葉小檗等同屬數(shù)種植物的干燥根，主要用于濕熱瀉痢、黃疸、濕疹、咽痛目赤等癥，小檗堿的含量是目前對(duì)三顆針?biāo)幉?、飲片質(zhì)量控制的主要依據(jù)[1]。但隨著對(duì)三顆針生物活性及化學(xué)成分的深入研究，發(fā)現(xiàn)巴馬汀、小檗胺、尖刺堿均具有較為顯著的生物活性，且含量較高[2～4]，在多個(gè)品種中均有分布，亦可納入三顆針?biāo)幉馁|(zhì)量控制體系。目前雖有用高效液相色譜法測(cè)定三顆針中小檗堿、巴馬汀的含量[5]，但因某些對(duì)照品（如尖刺堿提純難度較大）難以獲得或分析成本過高等，還未見用外標(biāo)法同時(shí)測(cè)定三顆針中小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺含量的文獻(xiàn)報(bào)道，這對(duì)三顆針?biāo)幉倪M(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量控制造成了較大困難。

一測(cè)多評(píng)法（QAMS）以樣品中某一成分為內(nèi)參物，建立該成分與其他成分間的相對(duì)響應(yīng)因子，通過相對(duì)響應(yīng)因子計(jì)算其他成分含量。該方法能有效解決多指標(biāo)質(zhì)量控制面臨的對(duì)照品短缺和檢測(cè)成本高昂等問題，實(shí)現(xiàn)了多成分同步測(cè)定[6]，目前已應(yīng)用于黃連、補(bǔ)骨脂、虎杖等中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)[7～9]，其中黃連一測(cè)多評(píng)的含量測(cè)定方法已收入2010年版《中華人民共和國藥典》。

針對(duì)三顆針中生物堿類對(duì)照品外缺現(xiàn)狀，為滿足對(duì)三顆針進(jìn)行全面質(zhì)量監(jiān)控的迫切需求，筆者應(yīng)用一測(cè)多評(píng)法對(duì)三顆針中小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的含量進(jìn)行測(cè)定，從而對(duì)三顆針進(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量控制。以價(jià)廉易得的小檗堿作為內(nèi)參物，通過建立其與巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的相對(duì)校正因子進(jìn)行含量計(jì)算，并考察該方法的耐用性及系統(tǒng)適用性，探討一測(cè)多評(píng)法在三顆針?biāo)幉亩嘀笜?biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)中的適用性和準(zhǔn)確性。

1 儀器與材料

Thermo U3 000高效液相色譜系統(tǒng)，Chromeleon 7.1工作站，Agilent 1 260高效液相系統(tǒng)，Agilent chemstation工作站；AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，CAPCELL PAK

C18 MG II(4.6 mm×250 mm，5μm)；KQ-100 超聲儀（ 40 KW）；乙腈、甲醇為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純。鹽酸小檗堿（110 713-201 212）和鹽酸巴馬?。?10 732-201 309）購自中國藥品生物制品檢定所，鹽酸尖刺堿（1 745-1）和鹽酸小檗胺（A0 619）購自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司，三顆針?biāo)幉暮惋嬈徸运拇?、貴州、云南等地，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院封士蘭教授鑒定為細(xì)葉小檗的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 一測(cè)多評(píng)方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱為AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，CAPCELL PAK C18 MG II(4.6 mm ×250 mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈 -0.02mol／L磷酸二氫鉀溶液(25∶75)，柱溫30℃，流速0.6ml·min-1，檢測(cè)波長232 nm。在上述色譜條件下，各組分離度良好，見圖1。

圖1 三顆針?biāo)幉闹?種生物堿色譜圖

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取小檗堿、巴馬汀、尖刺堿與小檗胺4 種生物堿，精密稱定，分別為 7.63、8.04、16.38、11.28 mg 置于10m l量瓶中，用甲醇定容至刻度，精密移取上述4個(gè)對(duì)照品溶液各1m l，置于50 m l量瓶中，加甲醇定容至刻度，為混標(biāo)溶液。將上述混標(biāo)保存于4℃冰箱中，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品三顆針?biāo)幉姆勰ㄟ^40目篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇—鹽酸（ 90∶1）50 m l，密塞，稱定重量，水浴回流 30 min，再超聲處理(功率250W，頻率40 kHz)1h，放冷，再稱定重量，用甲醇—鹽酸（90∶1）補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45μm濾膜，5μl進(jìn)樣。

2.1.4 線性范圍 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液40、30、20、10、8、6、4、2、1μl，進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度進(jìn)樣 3 次，取平均值。以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行回歸處理，得巴馬汀、尖刺堿、小檗胺與小檗堿的回歸方程（見表1）。

表1 三顆針?biāo)幉闹?種生物堿的回歸方程

2.1.5 校正因子計(jì)算 以小檗堿為內(nèi)標(biāo)物，計(jì)算小檗堿對(duì)巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的校正因子，見表2。

表2 三顆針?biāo)幉闹懈魃飰A的相對(duì)校正因子

2.1.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液5μl，于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的峰面積，得出日內(nèi)精密度分別為0.9%、0.8%、0.6%、1.3%；精密吸取同一供試品溶液5μl連續(xù)進(jìn)樣3 d，每天3次，記錄峰面積，以上4個(gè)生物堿成分的日間精密度分別為 2.1%、1.5%、1.4%、2.8%。表明儀器較為穩(wěn)定。

2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液5μl，分別于配制后的 0、2、4、8、12、24 h 測(cè)定面積積分值，小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺穩(wěn)定性的RSD分別為1.3%、1.1%、2.2%、0.9%。表明處理后的樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取三顆針（產(chǎn)地四川）藥材粉末（40目）約0.1 g共6份，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)下制備樣品，測(cè)定小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的平均含量分別為34.14、16.32、10.74、11.56 mg·g-1，RSD 分別為 2.1%、1.9%、2.6%、2.7%、表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率 精密稱取適量已知含量的三顆針?biāo)幉姆勰?0目）6份，加入一定量的“2.1.2”項(xiàng)下（小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺）對(duì)照品溶液各1m l，按“2.1.3”項(xiàng)下制備樣品，測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的加樣回收率分別為100.5% 、99.8%、101.1%、102.6%，RSD分別為2.2%、1.8%、1.9%、2.4%、表明該方法的回收率良好。

2.2 校正因子的重現(xiàn)性考察

2.2.1 色譜柱及高效液相色譜儀考察 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣 10、5、2、1、0.5 μl測(cè)定，按“ 2.1.5”項(xiàng)下計(jì)算小檗堿對(duì)巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的校正因子。實(shí)驗(yàn)考察了Thermo U3000和Agilent1 260兩種高效液相色譜系統(tǒng)，AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，CAPCELL PAK C18 MG II(4.6 mm×250mm，5μm)兩種色譜柱，結(jié)果見表3。

2.2.2 同一品牌儀器不同實(shí)驗(yàn)室的考察 對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室同一品牌儀器建立的一測(cè)多評(píng)方法進(jìn)行復(fù)核，儀器為Thermo U 3 000，色譜柱為 AcclaimTM 120 C18（ 4.6mm×250mm，5μm），以10、5、2、1、0.5μl進(jìn)樣測(cè)定個(gè)各成分相對(duì)校正因子，結(jié)果見表4。

表3 不同儀器和色譜柱測(cè)得相對(duì)校正因子

表4 不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)得相對(duì)校正因子

在建立小檗堿與其余3種生物堿類成分間的相對(duì)校正因子的評(píng)價(jià)中，我們考察了不同色譜柱、液相色譜系統(tǒng)和實(shí)驗(yàn)室對(duì)校正因子的影響，結(jié)果表明，以上建立的校正因子具有較好的可信度。

2.2.3 待測(cè)組分色譜峰的定位 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,可通過保留時(shí)間差和相對(duì)保留值進(jìn)行峰定位，結(jié)果見表5。據(jù)結(jié)果可知，兩種定位方法的RSD≤5.0%，說明這兩種方法均能準(zhǔn)確判斷巴馬汀、尖刺堿、小檗胺色譜峰的位置。但因保留時(shí)間差波動(dòng)較為明顯，相對(duì)保留值波動(dòng)較小，所以選擇相對(duì)保留值來定位待測(cè)組分色譜峰。

表5 不同儀器和色譜柱測(cè)得的相對(duì)保留值

2.3 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法結(jié)果比較研究

分別精密吸取供試品溶液各5μl注入高效液相色譜儀，測(cè)定。采用外標(biāo)兩點(diǎn)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算三顆針?biāo)幉闹邪婉R汀、尖刺堿、小檗胺的含量，結(jié)果見表6。

由表6可知，常規(guī)的外標(biāo)法實(shí)測(cè)含量值與一測(cè)多評(píng)計(jì)算含量值比較無顯著性差異(RSD＜5.0%)。由此說明一測(cè)多評(píng)法可用于三顆針?biāo)幉牡亩嘀笜?biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)選用超聲、回流和回流后超聲等不同提取方法，考察不同提取方法對(duì)三顆針中生物堿提取效率的影響，得出結(jié)論：水浴回流30min，再超聲處理(功率250W，頻率40 kHz)1h，藥材中的生物堿提取效率較高。

3.2 提取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)選用甲醇、乙醇和丙酮3種提取溶劑，以及加酸與否和加酸的比例，得出結(jié)論：用甲醇—鹽酸（90∶1），藥材中的生物堿提取較為完全。

表6 外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法（內(nèi)標(biāo)法）測(cè)定三顆針中生物堿含量的比較 (%，n=3)

3.3 流動(dòng)相的選擇

比較甲醇、水、磷酸不同用量和流動(dòng)相不同pH值對(duì)鹽酸小檗堿的保留時(shí)間及其相鄰峰分離度的影響。結(jié)果表明乙腈-0.02mol／L磷酸二氫鉀溶液(25∶75)，保留時(shí)間適當(dāng)分離效果較好，與其它方法相比，該方法所采用的流動(dòng)相具有簡便、柱污染小、分離度好的優(yōu)點(diǎn)。

3.4 內(nèi)標(biāo)物的選擇

本實(shí)驗(yàn)選用小檗堿為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行一測(cè)多評(píng)法的理由是：小檗堿不僅是三顆針中主要藥效成分，而且是2010年版《中華人民共和國藥典》中三顆針質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，并且其含量較高，性質(zhì)穩(wěn)定，價(jià)廉易得。

3.5 小結(jié)

本研究初步建立了一測(cè)多評(píng)法，通過測(cè)定12個(gè)批次三顆針中4種生物堿類成分，結(jié)果表明，一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法得到的含量值之間沒有顯著性差異（RSD＜5.0%)，說明建立的校正因子具有較好的可信度，可在對(duì)照品外缺時(shí)，通過一測(cè)多評(píng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)同步測(cè)定三顆針?biāo)幉闹猩飰A類成分的多個(gè)指標(biāo)成分，為三顆針?biāo)幉亩嘀笜?biāo)質(zhì)量控制體系提供了更加便捷、科學(xué)的檢測(cè)方法。

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R284.1

A

1671-1246（2015）15-0113-04