田妮娜 ，封士蘭 ，周 麗

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

一測多評法測定三顆針中4種生物堿類成分的含量

田妮娜1，2，封士蘭1，周 麗3

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

目的建立三顆針中小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺一測多評法，驗證該方法的可行性和技術(shù)適應(yīng)性。方法 以小檗堿為指標，計算巴馬汀、尖刺堿、小檗胺與小檗堿的相對校正因子，并用該校正因子進行巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的含量計算，同時采用外標法測定三顆針中該4種生物堿的含量，并比較外標法與一測多評法的結(jié)果，以驗證一測多評法的準確性和可行性。結(jié)果 外標法與一測多評法的結(jié)果無顯著性差異（RSD＜5.0%）。結(jié)論 以一測多評法測定三顆針中小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的含量是準確可行的。

一測多評法；三顆針；生物堿；外標法

三顆針為常用中藥，是小檗科植物擬獠豬刺、小黃連刺、細葉小檗或匙葉小檗等同屬數(shù)種植物的干燥根，主要用于濕熱瀉痢、黃疸、濕疹、咽痛目赤等癥，小檗堿的含量是目前對三顆針藥材、飲片質(zhì)量控制的主要依據(jù)[1]。但隨著對三顆針生物活性及化學(xué)成分的深入研究，發(fā)現(xiàn)巴馬汀、小檗胺、尖刺堿均具有較為顯著的生物活性，且含量較高[2～4]，在多個品種中均有分布，亦可納入三顆針藥材質(zhì)量控制體系。目前雖有用高效液相色譜法測定三顆針中小檗堿、巴馬汀的含量[5]，但因某些對照品（如尖刺堿提純難度較大）難以獲得或分析成本過高等，還未見用外標法同時測定三顆針中小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺含量的文獻報道，這對三顆針藥材進行多指標質(zhì)量控制造成了較大困難。

一測多評法（QAMS）以樣品中某一成分為內(nèi)參物，建立該成分與其他成分間的相對響應(yīng)因子，通過相對響應(yīng)因子計算其他成分含量。該方法能有效解決多指標質(zhì)量控制面臨的對照品短缺和檢測成本高昂等問題，實現(xiàn)了多成分同步測定[6]，目前已應(yīng)用于黃連、補骨脂、虎杖等中藥的質(zhì)量評價[7～9]，其中黃連一測多評的含量測定方法已收入2010年版《中華人民共和國藥典》。

針對三顆針中生物堿類對照品外缺現(xiàn)狀，為滿足對三顆針進行全面質(zhì)量監(jiān)控的迫切需求，筆者應(yīng)用一測多評法對三顆針中小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的含量進行測定，從而對三顆針進行多指標質(zhì)量控制。以價廉易得的小檗堿作為內(nèi)參物，通過建立其與巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的相對校正因子進行含量計算，并考察該方法的耐用性及系統(tǒng)適用性，探討一測多評法在三顆針藥材多指標質(zhì)量評價中的適用性和準確性。

1 儀器與材料

Thermo U3 000高效液相色譜系統(tǒng)，Chromeleon 7.1工作站，Agilent 1 260高效液相系統(tǒng)，Agilent chemstation工作站；AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，CAPCELL PAK

C18 MG II(4.6 mm×250 mm，5μm)；KQ-100 超聲儀（ 40 KW）；乙腈、甲醇為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純。鹽酸小檗堿（110 713-201 212）和鹽酸巴馬汀（110 732-201 309）購自中國藥品生物制品檢定所，鹽酸尖刺堿（1 745-1）和鹽酸小檗胺（A0 619）購自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司，三顆針藥材和飲片購自四川、貴州、云南等地，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院封士蘭教授鑒定為細葉小檗的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 一測多評方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱為AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，CAPCELL PAK C18 MG II(4.6 mm ×250 mm，5μm)；流動相為乙腈 -0.02mol／L磷酸二氫鉀溶液(25∶75)，柱溫30℃，流速0.6ml·min-1，檢測波長232 nm。在上述色譜條件下，各組分離度良好，見圖1。

圖1 三顆針藥材中4種生物堿色譜圖

2.1.2 對照品溶液的制備 取小檗堿、巴馬汀、尖刺堿與小檗胺4 種生物堿，精密稱定，分別為 7.63、8.04、16.38、11.28 mg 置于10m l量瓶中，用甲醇定容至刻度，精密移取上述4個對照品溶液各1m l，置于50 m l量瓶中，加甲醇定容至刻度，為混標溶液。將上述混標保存于4℃冰箱中，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品三顆針藥材粉末（過40目篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇—鹽酸（ 90∶1）50 m l，密塞，稱定重量，水浴回流 30 min，再超聲處理(功率250W，頻率40 kHz)1h，放冷，再稱定重量，用甲醇—鹽酸（90∶1）補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45μm濾膜，5μl進樣。

2.1.4 線性范圍 精密吸取上述混合對照品溶液40、30、20、10、8、6、4、2、1μl，進樣分析，每個濃度進樣 3 次，取平均值。以進樣量對峰面積積分值進行回歸處理，得巴馬汀、尖刺堿、小檗胺與小檗堿的回歸方程（見表1）。

表1 三顆針藥材中4種生物堿的回歸方程

2.1.5 校正因子計算 以小檗堿為內(nèi)標物，計算小檗堿對巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的校正因子，見表2。

表2 三顆針藥材中各生物堿的相對校正因子

2.1.6 精密度實驗 精密吸取同一供試品溶液5μl，于同一天內(nèi)連續(xù)進樣5次，記錄小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的峰面積，得出日內(nèi)精密度分別為0.9%、0.8%、0.6%、1.3%；精密吸取同一供試品溶液5μl連續(xù)進樣3 d，每天3次，記錄峰面積，以上4個生物堿成分的日間精密度分別為 2.1%、1.5%、1.4%、2.8%。表明儀器較為穩(wěn)定。

2.1.7 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液5μl，分別于配制后的 0、2、4、8、12、24 h 測定面積積分值，小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺穩(wěn)定性的RSD分別為1.3%、1.1%、2.2%、0.9%。表明處理后的樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性實驗 稱取三顆針（產(chǎn)地四川）藥材粉末（40目）約0.1 g共6份，精密稱定，按“2.1.3”項下制備樣品，測定小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的平均含量分別為34.14、16.32、10.74、11.56 mg·g-1，RSD 分別為 2.1%、1.9%、2.6%、2.7%、表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率 精密稱取適量已知含量的三顆針藥材粉末（40目）6份，加入一定量的“2.1.2”項下（小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺）對照品溶液各1m l，按“2.1.3”項下制備樣品，測定，計算加樣回收率，小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的加樣回收率分別為100.5% 、99.8%、101.1%、102.6%，RSD分別為2.2%、1.8%、1.9%、2.4%、表明該方法的回收率良好。

2.2 校正因子的重現(xiàn)性考察

2.2.1 色譜柱及高效液相色譜儀考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，進樣 10、5、2、1、0.5 μl測定，按“ 2.1.5”項下計算小檗堿對巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的校正因子。實驗考察了Thermo U3000和Agilent1 260兩種高效液相色譜系統(tǒng)，AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，CAPCELL PAK C18 MG II(4.6 mm×250mm，5μm)兩種色譜柱，結(jié)果見表3。

2.2.2 同一品牌儀器不同實驗室的考察 對不同實驗室同一品牌儀器建立的一測多評方法進行復(fù)核，儀器為Thermo U 3 000，色譜柱為 AcclaimTM 120 C18（ 4.6mm×250mm，5μm），以10、5、2、1、0.5μl進樣測定個各成分相對校正因子，結(jié)果見表4。

表3 不同儀器和色譜柱測得相對校正因子

表4 不同實驗室測得相對校正因子

在建立小檗堿與其余3種生物堿類成分間的相對校正因子的評價中，我們考察了不同色譜柱、液相色譜系統(tǒng)和實驗室對校正因子的影響，結(jié)果表明，以上建立的校正因子具有較好的可信度。

2.2.3 待測組分色譜峰的定位 據(jù)文獻報道,可通過保留時間差和相對保留值進行峰定位，結(jié)果見表5。據(jù)結(jié)果可知，兩種定位方法的RSD≤5.0%，說明這兩種方法均能準確判斷巴馬汀、尖刺堿、小檗胺色譜峰的位置。但因保留時間差波動較為明顯，相對保留值波動較小，所以選擇相對保留值來定位待測組分色譜峰。

表5 不同儀器和色譜柱測得的相對保留值

2.3 一測多評法與外標法結(jié)果比較研究

分別精密吸取供試品溶液各5μl注入高效液相色譜儀，測定。采用外標兩點法和一測多評法計算三顆針藥材中巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的含量，結(jié)果見表6。

由表6可知，常規(guī)的外標法實測含量值與一測多評計算含量值比較無顯著性差異(RSD＜5.0%)。由此說明一測多評法可用于三顆針藥材的多指標成分質(zhì)量評價研究。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

本實驗選用超聲、回流和回流后超聲等不同提取方法，考察不同提取方法對三顆針中生物堿提取效率的影響，得出結(jié)論：水浴回流30min，再超聲處理(功率250W，頻率40 kHz)1h，藥材中的生物堿提取效率較高。

3.2 提取溶劑的選擇

本實驗選用甲醇、乙醇和丙酮3種提取溶劑，以及加酸與否和加酸的比例，得出結(jié)論：用甲醇—鹽酸（90∶1），藥材中的生物堿提取較為完全。

表6 外標法和一測多評法（內(nèi)標法）測定三顆針中生物堿含量的比較 (%，n=3)

3.3 流動相的選擇

比較甲醇、水、磷酸不同用量和流動相不同pH值對鹽酸小檗堿的保留時間及其相鄰峰分離度的影響。結(jié)果表明乙腈-0.02mol／L磷酸二氫鉀溶液(25∶75)，保留時間適當(dāng)分離效果較好，與其它方法相比，該方法所采用的流動相具有簡便、柱污染小、分離度好的優(yōu)點。

3.4 內(nèi)標物的選擇

本實驗選用小檗堿為內(nèi)標物進行一測多評法的理由是：小檗堿不僅是三顆針中主要藥效成分，而且是2010年版《中華人民共和國藥典》中三顆針質(zhì)量控制的指標性成分，并且其含量較高，性質(zhì)穩(wěn)定，價廉易得。

3.5 小結(jié)

本研究初步建立了一測多評法，通過測定12個批次三顆針中4種生物堿類成分，結(jié)果表明，一測多評法與外標法得到的含量值之間沒有顯著性差異（RSD＜5.0%)，說明建立的校正因子具有較好的可信度，可在對照品外缺時，通過一測多評技術(shù)實現(xiàn)同步測定三顆針藥材中生物堿類成分的多個指標成分，為三顆針藥材多指標質(zhì)量控制體系提供了更加便捷、科學(xué)的檢測方法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2]楊柳萌，王睿睿.四個小檗堿類化合物的體外抗HIV-1活性[J].中國天然藥物，2007，5（ 3）:225-228.

[3]Ivariovska N，Philipov S.Study on the anti-inflammatory action of Berberis vulgaris root extract，alkaloid fraetions and pure alkaloids[J].Int JImmunopharmac-01，1996，18（ 10）:553.

[4]范東旭，包海鷹.小檗屬植物中生物堿成分及藥理活性研究概述[J].人參研究，2012（ 2）：55-62.

[5]王柳卜，賈憲生，胡成剛，等.三顆針中鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿及鹽酸巴馬汀的含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥雜志，2011，2（ 1）:175-177.

[6]王智民，錢忠直，張啟偉，等.一測多評法建立的技術(shù)指南[J].中國中藥雜志，2011，36（ 6）:657-658.

[7]匡艷輝，朱晶晶，王智民，等.一測多評法測定黃連中小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿含量[J].中國中藥雜志，2009，44（ 5）:390-394.

[8]丁黎艷，周璐，王麗娜，等.一測多評法測定補骨脂中不同類型成分的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（ 5）：152-156.

[9]范玲，嚴冬，李爽，等.一測多評法測定虎杖中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素及大黃素甲醚的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（7）:103-106.

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1671-1246（2015）15-0113-04