隆旭紅，金文麗

（嘉峪關(guān)市食品藥品檢驗所，甘肅 嘉峪關(guān) 735100）

HPLC-ELSD法測定養(yǎng)血飲口服液中黃芪甲苷的含量

隆旭紅，金文麗

（嘉峪關(guān)市食品藥品檢驗所，甘肅 嘉峪關(guān) 735100）

目的探討用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定養(yǎng)血飲口服液中黃芪甲苷含量的方法。方法 采用Sinochrom ODS-AP（4.6×250mm，5μm）色譜柱，梯度洗脫，流動相A為乙腈，流動相B為水，流速1.0ml/min，柱溫30℃，進樣量20μl；蒸發(fā)光散射檢測器條件：漂移管溫度45℃，壓縮空氣壓力350 kPa。在以上條件下測定養(yǎng)血飲口服液中黃芪甲苷的含量。結(jié)果在本色譜條件下，黃芪甲苷與其他峰分離良好，在54.18～866.80μg/ml（R2=0.999 1）的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為101.3%，RSD為0.88%（n=9）。結(jié)論 HPLC-ELSD法準(zhǔn)確度高、專屬性強，可用于養(yǎng)血飲口服液中黃芪甲苷的含量測定。

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法；養(yǎng)血飲口服液；黃芪甲苷

養(yǎng)血飲口服液是由黃芪、當(dāng)歸、鹿角膠、阿膠等制成的，具有補氣養(yǎng)血、益腎助脾之功效，主治氣血兩虧、崩漏下血，體虛羸弱、血小板減少及貧血，對放療和化療后引起的白細胞減少也有一定的治療作用。方中的黃芪為君藥，黃芪甲苷為其主要指標(biāo)成分和有效成分之一，能夠增強機體免疫力、提高機體抗病能力，具有抗病毒作用，還能增強細胞生理代謝作用，促進血液循環(huán)，亦可改善心肺功能。本文參考相關(guān)文獻[1-10]，經(jīng)過方法學(xué)的論證結(jié)果表明，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（HPLC-ELSD）簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可以作為黃芪質(zhì)量控制的方法，并具有廣泛的應(yīng)用價值。

1 儀器與試藥

LC-20AT高效液相色譜儀；ELSD-LT II低溫型蒸發(fā)光散射檢測器;METTLER MS205DU電子天平；乙腈（色譜純）；水為超純水；黃芪甲苷對照品（批號：110781-200613，中國食品藥品檢定研究院）；市售養(yǎng)血飲口服液（批號：130451，生產(chǎn)廠家：山東步長制藥股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Sinochrom ODS-AP（4.6×250mm，5μm）；流動相：以乙腈為流動相A，以水為流動相B；流速：1.0 m l/min；柱溫30℃，漂移管溫度45℃；壓縮空氣壓力350 kPa；進樣量20μl，在以上條件下進行梯度洗脫，程序見表1。理論板數(shù)應(yīng)不低于4 000。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對照品儲備液的制備

將黃芪甲苷對照品置于盛有五氧化二磷的減壓干燥器中干燥12小時后，精密稱取21.67mg，置于10m l量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。

2.3 對照品溶液的制備

精密量取上述對照品儲備液5.0m l置50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.4 供試品溶液的制備

精密量取養(yǎng)血飲口服液20.0 m l，置于錐形瓶中，加甲醇50 m l超聲提取30分鐘，取出，冷卻，過濾，用甲醇洗滌濾紙并沉淀兩次，每次5 m l，水浴蒸干，殘渣加5%氯化鈉溶液30 m l使溶解，加用水飽和的正丁醇，并提取3次，每次30m l，合并正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 m l量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.5 線性關(guān)系的證明

取上述對照品溶液，分別取樣 5μl、10μl、20μl、40μl、60μl、80μl，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。Y=1.02×107X-66 820（r=0.999 5，n=6），表明濃度與峰面積在 54.18～866.80μg/ml的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6 檢出限與定量限

精密量取上述對照品儲備液，用甲醇逐級稀釋后取20μl在上述色譜條件下測定，記錄色譜圖，并對色譜系統(tǒng)進行基線檢測。分別以信噪比3∶1和10∶1確定檢出限和定量限，檢出限為 5.40μg/ml，定量限為 18.00μg/m l。

2.7 精密度實驗

精密量取上述對照品溶液20μl，連續(xù)進樣5次，記錄色譜圖，以峰面積計算，RSD為1.20%（n=6）。結(jié)果表明儀器的精密度良好，見表2。

表2 精密度測定結(jié)果

2.8 加樣回收率實驗

取已測得黃芪甲苷含量的同一批號（130451）的養(yǎng)血飲口服液，精密量取9份，每份20.0ml，3份為一組，分別精密加入對照品儲備液0.4ml、0.5ml、0.6ml，即按對照品溶液濃度的80%、100%、120%配制，置于盛有樣品的錐形瓶中，按“2.4”項制備，在上述色譜條件下，按外標(biāo)法以峰面積計算回收率，平均回收率為101.3%，RSD為0.88%（n=9）。實驗結(jié)果表明，本法有良好的回收率。

2.9 穩(wěn)定性實驗

取上述對照品溶液，按上述色譜條件，于0小時、2小時、4小時、8小時、12小時進樣，記錄色譜圖。結(jié)果峰形無改變，峰面積的RSD為0.71%，說明對照品溶液在12小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 重復(fù)性實驗

選取市售同一批號（130451）的養(yǎng)血飲口服液，精密量取5份，每份20.0m l，按“2.4”項制備。分別精密量取對照品溶液和供試品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算黃芪甲苷的含量，結(jié)果分別為：0.582 mg/支、0.601mg/支、0.594mg/支、0.587mg/支、0.603 mg/支，RSD為 0.96%（n=5）。

3 討論

3.1 流動相的選擇

參考《中國藥典》2010年版一部黃芪的含量測定，其流動相為乙腈-水（32∶68），在實際實驗中，色譜的峰形不好，且峰面積不穩(wěn)定；采用乙腈-水（45∶55）為流動相時，出峰太快，樣品中黃芪甲苷與其他峰分離不好。經(jīng)過反復(fù)實驗，本文采用梯度洗脫，保證了分離度和理論板數(shù)符合要求。

3.2 漂移管溫度和壓縮空氣壓力的選擇

由于本文采用的是低溫型蒸發(fā)光散射檢測器，在40℃、45℃、50℃進行實驗，最后確定在45℃時峰形好、出峰時間穩(wěn)定、峰面積穩(wěn)定；壓縮空氣壓力經(jīng)過反復(fù)調(diào)節(jié)、實驗，最后確定在（350±5）kPa。

3.3 計算方法的選擇

本文經(jīng)過一系列方法學(xué)論證，證明線性關(guān)系良好，可以采用外標(biāo)法以峰面積計算樣品的含量。

3.4 樣品的預(yù)處理

本文采用的提取方法能夠?qū)ⅫS芪甲苷提取完全，在樣品測定時受其他成分影響較小。

3.5 檢測方法

由于黃芪甲苷在紫外區(qū)只有末端被吸收，若采用HPLCUV法檢測，效果不好；若采用薄層掃描法，其操作復(fù)雜，穩(wěn)定性、重復(fù)性相對較差，方法誤差較大且組分干擾嚴(yán)重。故本文采用HPLC-ELSD法進行檢測。

3.6 養(yǎng)血飲口服液中黃芪甲苷的含量測定

可采用 Sinochrom ODS-AP（4.6×250 mm，5μm）色譜柱，梯度洗脫，流動相A為乙腈，流動相B為水，流速1.0m l/min，柱溫30℃，進樣量20μl；蒸發(fā)光散射檢測器條件：漂移管溫度45℃，壓縮空氣壓力350 kPa。在以上條件下測定養(yǎng)血飲口服液中黃芪甲苷的含量。

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1671-1246（2015）16-0082-03