顏明王東興王艷美王寶慶

（1牡丹江市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，黑龍江 牡丹江 157011；2牡丹江心血管醫(yī)院；3牡丹江靈泰藥業(yè)股份有限公司）

小兒啟脾片微生物限度檢查方法驗(yàn)證研究

顏明1王東興2王艷美3王寶慶1

（1牡丹江市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，黑龍江 牡丹江 157011；2牡丹江心血管醫(yī)院；3牡丹江靈泰藥業(yè)股份有限公司）

目的：驗(yàn)證小兒啟脾片微生物限度檢查的方法。方法：采用《中國藥典》2010年版一部附錄ⅧC微生物限度檢查法，對(duì)小兒啟脾片進(jìn)行微生物限度檢查。通過3次獨(dú)立的平行試驗(yàn),分別計(jì)算5種驗(yàn)證菌每次試驗(yàn)的回收率。采用在相同環(huán)境下培養(yǎng)和觀察大腸埃希菌與金黃色葡萄球菌的方法來驗(yàn)證控制菌。結(jié)果：5種驗(yàn)證菌的回收率均高于70%；控制菌檢查中,試驗(yàn)組均檢出驗(yàn)證菌,陰性菌對(duì)照組均無生長。結(jié)論：可以采用常規(guī)方法檢查小兒啟脾片的微生物限度。

小兒啟脾片；微生物限度檢查；方法學(xué)驗(yàn)證

小兒啟脾片是《國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》所收載的品種，該藥品是由人參、山藥、山楂、茯苓、蓮子、白術(shù)、陳皮、澤瀉、麥芽、六神曲10味藥組成的復(fù)方制劑，主要用于治療脾胃虛弱，食欲不振，消化不良，腹脹便溏等。本組方中山楂、白術(shù)、陳皮和六神曲[1-5]均報(bào)道有抗菌或抑菌的作用，因此按照常法檢驗(yàn)其微生物限度得到的結(jié)果不準(zhǔn)確，根據(jù)《中國藥典》2010年版規(guī)定，必須采用方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)說明微生物限度檢查法結(jié)果準(zhǔn)確性和試驗(yàn)方法的可靠性[6]。本研究對(duì)小兒啟脾片微生物限度檢查方法驗(yàn)證研究報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

BSC-1100ⅡB2生物安全柜；PL202-L電子天平；PL202-L架盤藥物天平；LDEX-40Ⅱ立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋；360-HHB-420BS恒溫培養(yǎng)箱；HPS-280生化培養(yǎng)箱；CJ-C-DⅡ?qū)恿鳚崈艄ぷ髋_(tái)；SY101-S-Z電熱鼓風(fēng)干燥箱；LDE4-1.2離心機(jī)；HHS11-2-Ⅱ電熱恒溫水浴器。

1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：130228）；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：130111）；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 （批號(hào)：130922）；膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號(hào)：131012）；曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）（批號(hào)：130111）；改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)：130110）；4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）（批號(hào)：130117），均由北京叁藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)，中國食品藥品檢定研究院監(jiān)制。

1.3 樣品

小兒啟脾片（牡丹江靈泰藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)：140102，140103，140104）。

1.4 驗(yàn)證菌種

枯草桿菌CMCC（B）63501，金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003，大腸埃希菌 CMCC（B）44102，白色念珠菌CMCC（F）98001，黑曲霉CMCC（F）98003，均由中國食品藥品檢定研究院提供，本試驗(yàn)所使用的菌株均為第3代。

2 方法和結(jié)果

2.1 菌液制備

參照《中國藥典》2010年版一部附錄[6]方法，接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)33～35℃培養(yǎng)18～ 35小時(shí)，接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，經(jīng)23～28℃培養(yǎng)18～24小時(shí)后，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液按10倍稀釋法依次稀釋，金黃色葡萄球菌稀釋至 10-7、大腸埃希菌稀釋至10-7、枯草芽孢桿菌稀釋至10-6，白色念珠菌稀釋至10-6，制成約為50～100 cfu/m L的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)25℃培養(yǎng)7天，用5 m L含有0.05%聚山梨酯80的 0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫孢子，吸取此溶液1 m L，用含有0.05%聚山梨酯80的 0.9%無菌氯化鈉溶液按10倍稀釋法稀釋至10-5，約為50～ 100 cfu/m L，做活菌計(jì)數(shù)備用，本試驗(yàn)所使用的菌液均為第1代。

2.2 pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨稀釋劑制備

pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨稀釋劑按照《中國藥典》2010年版一部附錄[7]方法制備。

2.3 供試液制備

取樣品10 g，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨稀釋劑100 m L，混勻，取約10 m L離心5分鐘，500轉(zhuǎn)/分鐘，取上清液做為1∶10的供試液。

2.4 細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證（平皿法）

2.4.1 試驗(yàn)組取1∶10的供試液1 m L與上述制備好的陽性對(duì)照菌液1 m L置于平皿中，立即加入15～20m L相應(yīng)培養(yǎng)基，待凝固后置規(guī)定條件下培養(yǎng)，測定所加的試驗(yàn)菌數(shù)，每株菌制備 10個(gè)平皿，逐日觀察結(jié)果，計(jì)數(shù)。

2.4.2 菌液組取上述各菌液1 m L分別加入平皿中，立即加入15～ 20 m L相應(yīng)培養(yǎng)基，待凝固后置規(guī)定條件下培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果，測定每一菌株所加的試驗(yàn)菌數(shù)，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿。

2.4.3 供試品對(duì)照組除不加菌液外，方法同試驗(yàn)組，測定供試品本底菌數(shù)。每株菌制備10個(gè)平皿。

2.4.4 稀釋劑對(duì)照組取pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨稀釋劑1 m L代替供試液，方法同試驗(yàn)組，測定所加的試驗(yàn)菌數(shù)，每株菌制備10個(gè)平皿。

2.4.5 計(jì)算

試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù) × 100%。

2.4.6 試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.5 控制菌檢查方法驗(yàn)證

2.5.1 大腸埃希菌和大腸菌群菌種：陽性對(duì)照菌——大腸埃希菌 （44102）；陰性對(duì)照菌——金黃色葡萄球菌（26003）。

2.5.2 試驗(yàn)組取1∶10的供試品10 m L加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 m L中，加入陽性對(duì)照菌大腸埃希菌菌液1 m L，搖勻，置35～ 37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，按相應(yīng)的控制菌檢查法檢查。大腸埃希菌濃度同細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證。

2.5.3 陰性對(duì)照組方法同試驗(yàn)組，取100 m L膽

鹽乳糖培養(yǎng)基，加入1 m L陰性對(duì)照菌金黃色葡萄球菌，置35～ 37℃培養(yǎng)18～ 24小時(shí)，按相應(yīng)的控制菌檢查法檢查。金黃色葡萄球菌濃度同細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證。

2.5.4 試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)驗(yàn)證結(jié)果

表2 控制菌檢查結(jié)果

3 討論

小兒啟脾片是含有多種有效成分的中藥復(fù)方制劑，其中任何成分具有抑菌作用都可能影響微生物限度檢查的準(zhǔn)確性，因此本文以《中國藥典》2010年版一部微生物限度檢查法為依據(jù)，采用5種陽性對(duì)照菌的回收率試驗(yàn)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，確定了小兒啟脾片微生物限度檢查的方法。

由表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，試驗(yàn)組的回收率大于70%，平行3次試驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定，結(jié)果表明可以采用常規(guī)法以1∶10的溶液作為供試品溶液進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)的檢查；由表2可知，陰性對(duì)照組未檢出大腸埃希菌和大腸菌群，試驗(yàn)組檢出了大腸埃希菌和大腸菌群，結(jié)果表明可以采用常規(guī)法進(jìn)行本品的控制菌大腸埃希菌和大腸菌群的檢查。綜上所述，常規(guī)法用于小兒啟脾片的微生物限度檢查，結(jié)果可靠。

[1] 李建華，胡金林.山楂的藥理作用與臨床應(yīng)用[J].中國藥物濫用防治雜志，2011，17（6）：334-336.

[2] 吳士杰，李秋津，肖學(xué)鳳，等.山楂化學(xué)成分及藥理作用的研究[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2010，33（4）：316-319.

[3] 宿廷敏，王敏娟，阮時(shí)寶.白術(shù)的化學(xué)成分及藥理作用研究概述[J].貴陽學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，3（2）：32-35.

[4] 李偉偉，張國偉.陳皮黃酮類成分研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（24）：154-156.

[5] 王秋紅，付新，王長福，等.六神曲的抗菌活性研究[D].中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥炮制分會(huì)2009年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，2009.

[6] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（2010年版）一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅧC，79-88.

[7] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（2010年版）一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅧH，104.

Research on M ethod Validation of M icrobial Lim it Test for Pediatric Qipi Tablets

Yan M ing1，Wang Dongxing2，Wang Yanmei3，Wang Baoqing1（1 Food and Drug Inspection Testing Center of Mudanjiang City,Heilongjiang Mudanjiang 157011,China；2 Mudanjiang Cardiovascular Hospital;3 Mudanjiang Lingtai Pharmaceutical Co.,LTD.）

Objective:To validate the method of m icrobial limit test for pediatric qipi tablets.M ethods:The method of microbial limit test set forth in the appendixⅧ C of the Chinese Pharmacopoeia of 2010 edition was adopted to determine the microbial limit of pediatric qipi tablets.Through three independent parallel tests,the recovery of each test using five kinds of bacteria for validation was calculated respectively.In order to verify the control bacteria,E.coli and Staphylococcus aureus were cultured and observed at the same environment.Results:The recovery of five kinds of bacteria was all higher than 70%,and bacteria for validation were detected in the test group,but no grow th was observed in the negative control group.Conclusion:The conventional method can be used for the m icrobial limit test of pediatric qipi tablets.

Pediatric Qipi Tablets；M icrobial Lim it Test；Methodology Validation

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.05.005

2015-01-30）

顏明，女，副主任藥師。研究方向：藥品監(jiān)督檢驗(yàn)與藥品不良反應(yīng)監(jiān)測。E-mail：88934182@qq.com