吳芙蓉,姜 玲,何曉麗,張 瓊,李培芳,王 靜,姜 輝
(1.安徽省立醫(yī)院藥劑科,安徽 合肥 230001;
2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,安徽 合肥 230031)
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◇藥學(xué)研究◇
橙皮苷對化學(xué)性肝纖維化大鼠α-SMA表達(dá)的影響
吳芙蓉1,姜玲1,何曉麗1,張瓊1,李培芳1,王靜1,姜輝2
(1.安徽省立醫(yī)院藥劑科,安徽 合肥230001;
2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,安徽 合肥230031)
摘要:目的 觀察橙皮苷對化學(xué)性肝纖維化大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表達(dá)的影響,探討其可能的作用機(jī)制。方法 采用50%四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)每周2次,連續(xù)12周皮下注射的方法,誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型。造模后第7周,每天按50,100,200 mg·kg-1灌胃給予不同劑量的橙皮苷(hesperidin,HDN)和秋水仙堿(0.1 mg·kg-1),共6周。末次給藥后,禁食8 h,處置大鼠,分光光度法檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和肝組織羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)的含量;取固定部位肝臟組織,HE和Masson染色觀察肝組織病理損傷程度,免疫組化和RT-PCR技術(shù)檢測肝組織中α-SMA蛋白與mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與模型組相比,HDN (100,200 mg·kg-1)組不僅可改善大鼠肝纖維化損傷程度,降低ALT、AST、Hyp含量(P<0.05或P<0.01),還可減少肝組織中α-SMA蛋白與mRNA的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 HDN對化學(xué)性肝纖維化大鼠具有很好的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與抑制肝星狀細(xì)胞的活化、增殖有關(guān)。
關(guān)鍵詞:橙皮苷;肝纖維化;大鼠;α-平滑肌肌動蛋白
肝纖維化是一種常見病,多發(fā)病,是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段,屬可逆病變[1-2]。橙皮苷(hesperidin,HDN) 為二氫黃酮苷類化合物,具有抗炎、抗氧化、護(hù)肝等諸多藥理作用[3-4]。本實驗以前期研究為基礎(chǔ)[5-6],觀察橙皮苷對肝纖維化大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的影響,探討其可能的作用機(jī)制。
1材料和方法
1.1藥物橙皮苷,純度為80%,Sigma公司,批號:50162;秋水仙堿,西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號:20130307。
1.2動物SD大鼠,♂,體質(zhì)量(200±20)g,SPF級,購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,準(zhǔn)字號:Scxk(皖)2011-002。
1.3試劑丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)試劑盒,南京建成生物工程研究所;兔抗鼠α-SMA單克隆抗體,河北博海生物工程開發(fā)有限公司;PCR試劑盒,F(xiàn)ermentas公司。
1.4儀器1510型全波段酶標(biāo)儀,美國熱電公司;2306型顯微鏡,麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司;基因擴(kuò)增儀、圖像分析管理系統(tǒng),珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司。
1.5方法
1.5.1模型復(fù)制[7]雄性SD大鼠,按隨機(jī)數(shù)字表分為正常組、模型組、HDN 3個不同劑量組和陽性藥組,每組10只。按0.1 mL/100 g背部皮下注射50%CCl4(CCl4與橄欖油等體積混合),每周2次,持續(xù)12周,復(fù)制肝纖維動物模型。造模后第7周,灌胃給予50,100,200 mg·kg-1不同劑量的橙皮苷和秋水仙堿(0.1 mg·kg-1),每天1次,連續(xù)6周。
1.5.2血清ALT、AST的檢測末次給藥后,禁食8 h,麻醉大鼠,腹主動脈采血,室溫靜置2~3 h,4 000 r·min-1,離心15 min,分離血清,分光光度法檢測血清ALT、AST的含量。
1.5.3肝組織Hyp含量測定取相同部位肝組織,稱重,加生理鹽水制成10%的肝組織勻漿,分光光度法檢測肝組織中Hyp的含量。
1.5.4肝組織病理組織學(xué)檢查取同一部位肝臟組織,加4%多聚甲醛液固定,分別進(jìn)行HE和Masson染色。
1.5.5免疫組化技術(shù)測定肝組織中α-SMA蛋白的表達(dá)按試劑盒說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,光鏡下觀察、拍照,并結(jié)合陽性細(xì)胞百分比(a)及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱(b),以IHS=a×b為指標(biāo),對其進(jìn)行半定量分析[8]。
1.5.6RT-PCR測定肝組織中α-SMA mRNA的表達(dá)[9]采用TRIzol法抽提肝組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。α-SMA Forward:5’-TGGCCACTGCTGCTTCCTTCTTCTT-3’;Reverse:5’-GGGGCCAGCTTCGTCATACTCCTA-3’。按試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),并進(jìn)行凝膠電泳,攝像,以目標(biāo)條帶與β-actin的比值作為其相對表達(dá)量。
2結(jié)果
2.1橙皮苷對肝纖維化大鼠血清ALT、AST含量的影響模型組大鼠血清ALT、AST含量較正常組顯著升高(P<0.01);給予藥物干預(yù)6周后,橙皮苷(100,200 mg·kg-1)和秋水仙堿組與模型組相比,可顯著降低血清ALT、AST含量(P<0.05或P<0.01);橙皮苷(50 mg·kg-1)組血清ALT、AST含量無顯著性改變(P>0.05),結(jié)果見表1。此外,將各組ALT、AST指標(biāo)數(shù)據(jù),按其總均值轉(zhuǎn)化為兩分類資料,低水平組(小于均數(shù)組)和高水平組(大于等于均數(shù)組),再行Cochran Armitage 趨勢檢驗,ALT呈現(xiàn)顯著下降趨勢,趨勢χ2=6.63,P=0.001 0,AST趨勢檢驗不具有顯著性意義,見圖1。
2.2橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織Hyp含量的影響模型組肝組織中Hyp含量較正常組顯著升高(P<0.01);橙皮苷(100,200 mg·kg-1)和秋水仙堿組肝組織Hyp含量較模型組顯著下降(P<0.05或P<0.01);橙皮苷(50 mg·kg-1)組Hyp含量與模型組比較無顯著性改變(P>0.05),結(jié)果見表2。此外,仿前法進(jìn)行了Cochran Armitage 趨勢檢驗,結(jié)果不顯著(趨勢χ2=3.30,P=0.069),見圖2。
2.3橙皮苷對肝纖維化大鼠肝臟病理組織學(xué)改變的影響HE染色下,正常組大鼠肝細(xì)胞、肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝索排列整齊,無膠原纖維增生;模型組大鼠肝臟有大量的脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤,細(xì)胞核消失,并形成空泡,膠原結(jié)締組織增生;給予HDN和秋水仙堿干預(yù)后,肝組織病理損傷程度有好轉(zhuǎn)的趨勢,結(jié)果見圖3。Masson 染色下,正常組大鼠肝臟僅見匯管區(qū)周圍有少量細(xì)小的藍(lán)色膠原纖維;模型組大鼠肝臟有大量藍(lán)色膠原纖維增生,將肝小葉分隔成大小不等的假小葉;給予HDN和秋水仙堿灌胃干預(yù)后,各給藥組膠原沉積、結(jié)締組織增生情況明顯減少,結(jié)果見圖4。
2.4橙皮苷對肝纖維化大鼠α-SMA蛋白表達(dá)的影響α-SMA蛋白免疫組化染色以棕黃色為陽性表達(dá)。免疫組化染色與IHS評分結(jié)果顯示,α-SMA在正常組大鼠肝臟中呈低表達(dá),在模型組大鼠肝臟中呈廣泛性高表達(dá);與正常組相比,模型組IHS評分顯著高于正常組(P<0.01);與模型組相比,給予藥物干預(yù)6周后,橙皮苷(100,200 mg·kg-1)和秋水仙堿組α-SMA陽性表達(dá)量與IHS評分顯著降低(P<0.05或P<0.01);橙皮苷(50 mg·kg-1)組α-SMA陽性表達(dá)量與IHS評無顯著性改變(P>0.05),結(jié)果見圖5、表3。仍仿前法,進(jìn)行Cochran Armitage 趨勢檢驗,結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義(趨勢χ2=2.45,P=0.118),見圖6。
2.5橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織中α-SMA mRNA表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示,模型組大鼠肝臟中α-SMA mRNA表達(dá)較正常組顯著升高(P<0.01);給予藥物干預(yù)6周后,橙皮苷(100,200 mg·kg-1)和秋水仙堿組α-SMA mRNA表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01);橙皮苷(50 mg·kg-1)組肝組織中α-SMA mRNA表達(dá)無顯著性改變(P>0.05),結(jié)果見圖7。
表1 橙皮苷對肝纖維化大鼠血清ALT、AST含量的影響
表2 橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織Hyp含量的影響
圖2不同劑量橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織
Hyp含量的影響
表3 橙皮苷對肝纖維化大鼠α-SMA蛋白表達(dá)的IHS評分的影響
圖7橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織中α-SMA mRNA表達(dá)的影響
3討論
肝纖維化以細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為主要病理學(xué)特征,是向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段,屬于可逆病變[10]。CCl4誘發(fā)的肝纖維化動物模型,具有病變典型、模型成功率高、簡便、價廉、耗時短等優(yōu)點(diǎn),是常用的經(jīng)典肝纖維化動物模型之一,廣泛應(yīng)用于防治肝纖維化藥物的篩選與作用機(jī)制的研究[11-12]。
Hyp是膠原蛋白所特有的氨基酸,可反映膠原代謝的變化情況,與肝纖維化程度相平行,是評估膠原蛋白含量和肝纖維化程度的常用指標(biāo)[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),連續(xù)皮下注射50%CCl412周后,模型組大鼠Hyp含量顯著升高,HE染色亦顯示肝小葉結(jié)構(gòu)遭破壞,肝索排列紊亂,結(jié)締組織增生,并形成假小葉,表明肝纖維化模型復(fù)制成功;給予橙皮苷和秋水仙堿干預(yù)6周后,各給藥組Hyp含量顯著下降,肝組織損傷程度明顯減輕,提示橙皮苷對化學(xué)性肝纖維化大鼠具有很好的保護(hù)作用。
生理情況下,ALT、AST主要存在于肝臟細(xì)胞中,血清中含量較少。CCl4進(jìn)入體內(nèi)后,肝細(xì)胞遭到破壞,ALT、AST大量滲入血液,使血中含量升高。因此,血中ALT、AST的含量可反映肝損害的程度[14-15]。本研究顯示,橙皮苷干預(yù)6周后,能顯著降低血清中ALT、AST水平,提示橙皮苷能夠有效的改善肝纖維化大鼠的肝功能。
研究表明,肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的過度激活、增殖是肝纖維化形成的關(guān)鍵[16]。HSC激活后,轉(zhuǎn)變成具有增生活性、可產(chǎn)生纖維的肌成纖維細(xì)胞,表達(dá)α-SMA,并合成大量細(xì)胞外基質(zhì)。因此,α-SMA可作為HSC活化的相對特異性標(biāo)志[17]。本研究發(fā)現(xiàn),給予橙皮苷干預(yù)6周后,各給藥組大鼠肝組織中α-SMA蛋白和mRNA水平均顯著下降,提示橙皮苷對HSC活化有一定的抑制作用。
綜上,橙皮苷具有很好的抗化學(xué)性肝纖維化作用,其機(jī)制可能與抑制HSC的活化、增殖,從而減少膠原的合成有關(guān)。
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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.006
基金項目:國家自然科學(xué)基金(No 81102874)
(收稿日期:2015-09-08,修回日期:2015-10-15)
Effect of HDN on the expression of α-SMA in rats’ livers with
hepatic fibrosis
WU Fu-rong, JIANG Ling, HE Xiao-li, et al
(DepartmentofPharmacy,AnhuiProvincialHospital,Hefei,Anhui230001,China)
Abstract:Objective To observe the effect of hesperidin (HDN) on α-smooth muscle actin (α-SMA) expressions in livers of hepatic fibrosis rats and to explore the underlying mechanisms. Methods SD rats were randomized into control group, model group, HDN (50, 100, 200 mg·kg-1) groups and colchicines (0.1 mg·kg-1) group. Rat with liver fibrosis was induced by hypodermic injection carbon tetrachloride (CCl4), twice a week for 12 weeks. Then different doses of HDN and colchicine were administrated via gavage once a day from week 7 to 12 after liver fibrosis was induced. At the end of experiment, the levels of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), and hydroxyproline (Hyp) were measured by chromatometry. Meanwhile, liver samples were taken to examine the degree of liver fibrosis by HE and Masson. Moreover, the expressions of α-SMA in liver were observed by immunohistochemistry and transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results As compared with the model group, HDN (100, 200 mg·kg-1) not only obviously improved histopathological change, but also degraded the contents of ALT, AST and Hyp(P<0.05 or P<0.01). Meanwhile, HDN could effectively prevent the protein and mRNA expression of α-SMA(P<0.05 or P<0.01). Conclusion HDN has a powerful protective effect on liver fibrosis in rats, which might be partly associated with its effects on inhibiting the activation and proliferation of HSC.
Key words:hesperidin;liver fibrosis;rat;α-SMA