吳芙蓉，姜　玲，何曉麗，張　瓊，李培芳，王　靜，姜　輝

(1.安徽省立醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥　230001；

2. 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，安徽 合肥　230031)

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◇藥學研究◇

橙皮苷對化學性肝纖維化大鼠α-SMA表達的影響

吳芙蓉1，姜玲1，何曉麗1，張瓊1，李培芳1，王靜1，姜輝2

(1.安徽省立醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥230001；

2. 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，安徽 合肥230031)

摘要：目的 觀察橙皮苷對化學性肝纖維化大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達的影響，探討其可能的作用機制。方法 采用50%四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)每周2次，連續(xù)12周皮下注射的方法，誘導肝纖維化大鼠模型。造模后第7周，每天按50，100，200 mg·kg-1灌胃給予不同劑量的橙皮苷(hesperidin，HDN)和秋水仙堿(0.1 mg·kg-1)，共6周。末次給藥后，禁食8 h，處置大鼠，分光光度法檢測血清丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和肝組織羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)的含量；取固定部位肝臟組織，HE和Masson染色觀察肝組織病理損傷程度，免疫組化和RT-PCR技術檢測肝組織中α-SMA蛋白與mRNA的表達。結果 與模型組相比，HDN (100，200 mg·kg-1)組不僅可改善大鼠肝纖維化損傷程度，降低ALT、AST、Hyp含量(P<0.05或P<0.01)，還可減少肝組織中α-SMA蛋白與mRNA的表達(P<0.05或P<0.01)。結論 HDN對化學性肝纖維化大鼠具有很好的保護作用，其機制可能與抑制肝星狀細胞的活化、增殖有關。

關鍵詞：橙皮苷；肝纖維化；大鼠；α-平滑肌肌動蛋白

肝纖維化是一種常見病，多發(fā)病，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經階段，屬可逆病變[1-2]。橙皮苷(hesperidin，HDN) 為二氫黃酮苷類化合物，具有抗炎、抗氧化、護肝等諸多藥理作用[3-4]。本實驗以前期研究為基礎[5-6]，觀察橙皮苷對肝纖維化大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的影響，探討其可能的作用機制。

1材料和方法

1.1藥物橙皮苷，純度為80%，Sigma公司，批號：50162；秋水仙堿，西雙版納藥業(yè)有限責任公司，批號：20130307。

1.2動物SD大鼠，♂，體質量(200±20)g，SPF級，購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，準字號：Scxk(皖)2011-002。

1.3試劑丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)試劑盒，南京建成生物工程研究所；兔抗鼠α-SMA單克隆抗體，河北博海生物工程開發(fā)有限公司；PCR試劑盒，F(xiàn)ermentas公司。

1.4儀器1510型全波段酶標儀，美國熱電公司；2306型顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；基因擴增儀、圖像分析管理系統(tǒng)，珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司。

1.5方法

1.5.1模型復制[7]雄性SD大鼠，按隨機數(shù)字表分為正常組、模型組、HDN 3個不同劑量組和陽性藥組，每組10只。按0.1 mL/100 g背部皮下注射50%CCl4(CCl4與橄欖油等體積混合)，每周2次，持續(xù)12周，復制肝纖維動物模型。造模后第7周，灌胃給予50，100，200 mg·kg-1不同劑量的橙皮苷和秋水仙堿(0.1 mg·kg-1)，每天1次，連續(xù)6周。

1.5.2血清ALT、AST的檢測末次給藥后，禁食8 h，麻醉大鼠，腹主動脈采血，室溫靜置2～3 h，4 000 r·min-1，離心15 min，分離血清，分光光度法檢測血清ALT、AST的含量。

1.5.3肝組織Hyp含量測定取相同部位肝組織，稱重，加生理鹽水制成10%的肝組織勻漿，分光光度法檢測肝組織中Hyp的含量。

1.5.4肝組織病理組織學檢查取同一部位肝臟組織，加4%多聚甲醛液固定，分別進行HE和Masson染色。

1.5.5免疫組化技術測定肝組織中α-SMA蛋白的表達按試劑盒說明書進行免疫組織化學染色，光鏡下觀察、拍照，并結合陽性細胞百分比(a)及陽性細胞染色強弱(b)，以IHS=a×b為指標，對其進行半定量分析[8]。

1.5.6RT-PCR測定肝組織中α-SMA mRNA的表達[9]采用TRIzol法抽提肝組織總RNA，逆轉錄為cDNA。α-SMA Forward：5’-TGGCCACTGCTGCTTCCTTCTTCTT-3’；Reverse：5’-GGGGCCAGCTTCGTCATACTCCTA-3’。按試劑盒說明書進行擴增反應，并進行凝膠電泳，攝像，以目標條帶與β-actin的比值作為其相對表達量。

2結果

2.1橙皮苷對肝纖維化大鼠血清ALT、AST含量的影響模型組大鼠血清ALT、AST含量較正常組顯著升高(P<0.01)；給予藥物干預6周后，橙皮苷(100，200 mg·kg-1)和秋水仙堿組與模型組相比，可顯著降低血清ALT、AST含量(P<0.05或P<0.01)；橙皮苷(50 mg·kg-1)組血清ALT、AST含量無顯著性改變(P>0.05)，結果見表1。此外，將各組ALT、AST指標數(shù)據(jù)，按其總均值轉化為兩分類資料，低水平組(小于均數(shù)組)和高水平組(大于等于均數(shù)組)，再行Cochran Armitage 趨勢檢驗，ALT呈現(xiàn)顯著下降趨勢，趨勢χ2=6.63，P=0.001 0，AST趨勢檢驗不具有顯著性意義，見圖1。

2.2橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織Hyp含量的影響模型組肝組織中Hyp含量較正常組顯著升高(P<0.01)；橙皮苷(100，200 mg·kg-1)和秋水仙堿組肝組織Hyp含量較模型組顯著下降(P<0.05或P<0.01)；橙皮苷(50 mg·kg-1)組Hyp含量與模型組比較無顯著性改變(P>0.05)，結果見表2。此外，仿前法進行了Cochran Armitage 趨勢檢驗，結果不顯著(趨勢χ2=3.30，P=0.069)，見圖2。

2.3橙皮苷對肝纖維化大鼠肝臟病理組織學改變的影響HE染色下，正常組大鼠肝細胞、肝小葉結構完整，肝索排列整齊，無膠原纖維增生；模型組大鼠肝臟有大量的脂肪變性、炎性細胞浸潤，細胞核消失，并形成空泡，膠原結締組織增生；給予HDN和秋水仙堿干預后，肝組織病理損傷程度有好轉的趨勢，結果見圖3。Masson 染色下，正常組大鼠肝臟僅見匯管區(qū)周圍有少量細小的藍色膠原纖維；模型組大鼠肝臟有大量藍色膠原纖維增生，將肝小葉分隔成大小不等的假小葉；給予HDN和秋水仙堿灌胃干預后，各給藥組膠原沉積、結締組織增生情況明顯減少，結果見圖4。

2.4橙皮苷對肝纖維化大鼠α-SMA蛋白表達的影響α-SMA蛋白免疫組化染色以棕黃色為陽性表達。免疫組化染色與IHS評分結果顯示，α-SMA在正常組大鼠肝臟中呈低表達，在模型組大鼠肝臟中呈廣泛性高表達；與正常組相比，模型組IHS評分顯著高于正常組(P<0.01)；與模型組相比，給予藥物干預6周后，橙皮苷(100，200 mg·kg-1)和秋水仙堿組α-SMA陽性表達量與IHS評分顯著降低(P<0.05或P<0.01)；橙皮苷(50 mg·kg-1)組α-SMA陽性表達量與IHS評無顯著性改變(P>0.05)，結果見圖5、表3。仍仿前法，進行Cochran Armitage 趨勢檢驗，結果無統(tǒng)計學意義(趨勢χ2=2.45，P=0.118)，見圖6。

2.5橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織中α-SMA mRNA表達的影響RT-PCR結果顯示，模型組大鼠肝臟中α-SMA mRNA表達較正常組顯著升高(P<0.01)；給予藥物干預6周后，橙皮苷(100，200 mg·kg-1)和秋水仙堿組α-SMA mRNA表達較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01)；橙皮苷(50 mg·kg-1)組肝組織中α-SMA mRNA表達無顯著性改變(P>0.05)，結果見圖7。

表1　橙皮苷對肝纖維化大鼠血清ALT、AST含量的影響

表2　橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織Hyp含量的影響

圖2不同劑量橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織

Hyp含量的影響

表3　橙皮苷對肝纖維化大鼠α-SMA蛋白表達的IHS評分的影響

圖7橙皮苷對肝纖維化大鼠肝組織中α-SMA mRNA表達的影響

3討論

肝纖維化以細胞外基質過度沉積為主要病理學特征，是向肝硬化發(fā)展的必經階段，屬于可逆病變[10]。CCl4誘發(fā)的肝纖維化動物模型，具有病變典型、模型成功率高、簡便、價廉、耗時短等優(yōu)點，是常用的經典肝纖維化動物模型之一，廣泛應用于防治肝纖維化藥物的篩選與作用機制的研究[11-12]。

Hyp是膠原蛋白所特有的氨基酸，可反映膠原代謝的變化情況，與肝纖維化程度相平行，是評估膠原蛋白含量和肝纖維化程度的常用指標[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)皮下注射50%CCl412周后，模型組大鼠Hyp含量顯著升高，HE染色亦顯示肝小葉結構遭破壞，肝索排列紊亂，結締組織增生，并形成假小葉，表明肝纖維化模型復制成功；給予橙皮苷和秋水仙堿干預6周后，各給藥組Hyp含量顯著下降，肝組織損傷程度明顯減輕，提示橙皮苷對化學性肝纖維化大鼠具有很好的保護作用。

生理情況下，ALT、AST主要存在于肝臟細胞中，血清中含量較少。CCl4進入體內后，肝細胞遭到破壞，ALT、AST大量滲入血液，使血中含量升高。因此，血中ALT、AST的含量可反映肝損害的程度[14-15]。本研究顯示，橙皮苷干預6周后，能顯著降低血清中ALT、AST水平，提示橙皮苷能夠有效的改善肝纖維化大鼠的肝功能。

研究表明，肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的過度激活、增殖是肝纖維化形成的關鍵[16]。HSC激活后，轉變成具有增生活性、可產生纖維的肌成纖維細胞，表達α-SMA，并合成大量細胞外基質。因此，α-SMA可作為HSC活化的相對特異性標志[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予橙皮苷干預6周后，各給藥組大鼠肝組織中α-SMA蛋白和mRNA水平均顯著下降，提示橙皮苷對HSC活化有一定的抑制作用。

綜上，橙皮苷具有很好的抗化學性肝纖維化作用，其機制可能與抑制HSC的活化、增殖，從而減少膠原的合成有關。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.006

基金項目：國家自然科學基金(No 81102874)

(收稿日期：2015-09-08，修回日期：2015-10-15)

Effect of HDN on the expression of α-SMA in rats’ livers with
hepatic fibrosis

WU Fu-rong, JIANG Ling, HE Xiao-li, et al

(DepartmentofPharmacy,AnhuiProvincialHospital,Hefei,Anhui230001,China)

Abstract：Objective To observe the effect of hesperidin (HDN) on α-smooth muscle actin (α-SMA) expressions in livers of hepatic fibrosis rats and to explore the underlying mechanisms. Methods SD rats were randomized into control group, model group, HDN (50, 100, 200 mg·kg-1) groups and colchicines (0.1 mg·kg-1) group. Rat with liver fibrosis was induced by hypodermic injection carbon tetrachloride (CCl4), twice a week for 12 weeks. Then different doses of HDN and colchicine were administrated via gavage once a day from week 7 to 12 after liver fibrosis was induced. At the end of experiment, the levels of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), and hydroxyproline (Hyp) were measured by chromatometry. Meanwhile, liver samples were taken to examine the degree of liver fibrosis by HE and Masson. Moreover, the expressions of α-SMA in liver were observed by immunohistochemistry and transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results As compared with the model group, HDN (100, 200 mg·kg-1) not only obviously improved histopathological change, but also degraded the contents of ALT, AST and Hyp(P<0.05 or P<0.01). Meanwhile, HDN could effectively prevent the protein and mRNA expression of α-SMA(P<0.05 or P<0.01). Conclusion HDN has a powerful protective effect on liver fibrosis in rats, which might be partly associated with its effects on inhibiting the activation and proliferation of HSC.

Key words：hesperidin;liver fibrosis;rat;α-SMA