聶文波　汪明星　張振華　孫付杰

密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學特性

聶文波1汪明星2張振華1孫付杰1

【摘要】目的 通過密度梯度離心法結(jié)合全骨髓貼壁法體外分離、培養(yǎng)、純化骨髓間充質(zhì)干細胞。方法 采用密度梯度離心法結(jié)合全骨髓貼壁法，對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外分離后傳代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)變化，流式細胞儀檢測細胞標記物表達。結(jié)果 P3代大鼠BMSCs細胞培養(yǎng)5天，CD29、CD90、CD34陽性率分別為94.27%、91.16%、1.72%。結(jié)論 密度梯度離心法結(jié)合全骨髓貼壁法成功分離培養(yǎng)了高純度、高活性、生物學形態(tài)和特征穩(wěn)定的骨髓間充質(zhì)干細胞。

【關鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細胞；貼壁法篩選法；細胞培養(yǎng)

作者單位：1 274300 山東省菏澤市單縣中心醫(yī)院脊柱外科；2 221006徐州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院

間充質(zhì)干細胞（marrow mesenchymal stem cells, MSCs）來源于早期發(fā)育的胚層，在人體各器官組織內(nèi)分布相當廣泛，被稱為骨髓間充質(zhì)干細胞[1]。BMSCs作為一種多功能肝細胞，能在合適的前提下分化為：骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞等等。而BMSCs，來源豐富，同時還具備取材方便的優(yōu)點，因此非常適合進行體外培養(yǎng)，簡單有效、增值速度相當快，同時還可避免概念上的歧義，因此BMSCs廣泛應用于臨床醫(yī)學、檢驗學等多個領域，被學術界稱為織工程種子的最佳組細胞來源。本次研究應用密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)BMSCs，為進一步試驗提供細胞基礎。

1　材料與方法

1.1主要試驗材料及設備

SD大鼠，4周齡，體重120～200 g，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供；胎牛血清（FBS），塞默飛世爾生物公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基，塞默飛世爾生物公司；胰蛋白酶，Beyotime公司生產(chǎn)；Percoll分離液，上海Rego公司；恒溫箱，上海躍進醫(yī)療器械；5%CO2培養(yǎng)箱， Thermo電器公司；離心機，eppendorf公司；倒置相差顯微鏡，COIC公司；流式細胞儀，美國BD公司。

1.2方法

BMSCs的分離、培養(yǎng)及傳代、擴增：大白鼠處死后體積分數(shù)控制在75%，在乙醇中浸泡5 min，采用無菌操作分離大鼠股骨、脛骨，清除附著的肌肉組織，暴露骨髓腔并用PBS反復沖洗，收集細胞沖洗液并過篩網(wǎng)制成單細胞懸液，離心收集骨髓細胞，對管內(nèi)細胞用含有10%FBS的DMEM/F-12的培養(yǎng)基，進行懸浮離心操作，并計數(shù)。將細胞密度控制在2×106/ml，在25 cm2的培養(yǎng)瓶中進行接種。原代接種后，靜置培養(yǎng)，24 h后首次全量換液，之后每3 d全量換液。待細胞生長至80%～90%融合時，進行胰酶消化與傳代培養(yǎng)（按1：3的比例）[2]。

BMSCs的形態(tài)觀察學：對原代、傳代培養(yǎng)的BMSCs，在倒置相差顯微鏡下進行觀察，主要內(nèi)容包括細胞形態(tài)及生長情況，頻率為1次/d。

流式細胞儀法鑒定BMSCs分子表面標志：收集處于對數(shù)生長期的P3代細胞，胰酶消化、多聚甲醛固定后分為三管，分別加入稀釋的單克隆抗體（FITC標記CD29、CD90；單克隆抗體、PE標記CD34），充分混合后在室溫條件下避光孵育20min。用流式細胞儀檢測細胞表面分子標志，使用儀器自帶軟件記錄、分析并導出結(jié)果[3]。

2　結(jié)果

2.1BMSCSs的形態(tài)學觀察

接種24 h之后，后貼壁細胞與細胞貼壁增多現(xiàn)象明顯，倒置相差顯微鏡下細胞形態(tài)主要包括圓形和橢圓形。貼壁細胞形狀呈長梭形，未貼壁細胞形態(tài)圓且亮。2 d之后，貼壁細胞明顯增多、并有二角形、多邊形或者不規(guī)則形狀細胞出現(xiàn)，貼壁細胞呈團簇狀生長。5 d之后，細胞形態(tài)發(fā)生變化，呈大條的纖維狀，大量細胞呈外放射狀向外生長，細胞排列工整。原代培養(yǎng)7～9 d左右細胞融合率達到80%～90%，鋪滿瓶底，有傳代能力。剛傳代的細胞呈圓形，傳代培養(yǎng)的細胞生長速度較快，接種2～4 h后在倒置相差顯微鏡下即可發(fā)現(xiàn)有貼壁，細胞伸展生長，呈放射狀或不規(guī)則狀生長，細胞形態(tài)多樣，大部分為梭形；另一種形態(tài)為寬闊扁平狀，形態(tài)各異，細胞核為圓形或橢圓形，長滿后出現(xiàn)抑制且停止增殖。細胞培養(yǎng)至第三代時，倒置相差顯微鏡下觀察5 d即可達到80%～90%融合。

2.2SD大鼠BMSCs表面抗原鑒定

P3代大鼠BMSCs細胞培養(yǎng)5天，經(jīng)流式細胞儀檢測，CD29、CD90、CD34陽性率分別為94.27%、91.16%、1.72%。

3　討論

BMSCs的抗原表型具有多樣化特征，同時具備間充質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞與肌細胞的特征，無特異性標志。BMSCs與造血細胞共存于骨髓中，據(jù)文獻中數(shù)據(jù)解釋：BMSCs表面抗原主要有：CD90、CD105、CD29、SH-3、SH-4 CD44、CD71、CD106、SB-10等陽性表面抗原；另外，造血細胞不表達表面抗原的有：CD45（白細胞標志抗原），CD11（淋巴細胞表面抗原）與CD34（造血前體細胞抗源）。

綜上所述，用密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)的BMSCs，純度較高，并可以快速擴增并分化，細胞表型鑒定CD29、CD90陽性、CD34陰性，是細胞移植的理想種子細胞，有良好的應用前景。

參考文獻

[1] 吳國平，滕利，楊鍇，等. 密度梯度離心并貼壁法分離成人骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨特性[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(7)：1209-1212，1401.

[2] 曾瑞霞，單偉，房艷，等. 密度梯度離心法結(jié)合貼壁法體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞[J]. 解剖科學進展，2012，18(5)：438-441.

[3] 付文玉，路艷蒙，樸英杰. 人骨髓間充質(zhì)干細胞的分化與端粒酶活性[J]. 第一軍醫(yī)大學學報，2001，21(11)：801-804.

Biological Characteristics of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Isolated by Density Gradient Centrifugation Combined With Adherence Screening Method

NIE Wenbo1WANG Mingxing2ZHANG Zhenhua1SUN Fujie1, 1 Spine Surgery, Center Hospital of Shandong Heze Shanxian County, Heze 274300, China, 2 the Second Hospital Affiliated to Xuzhou Medical College, Xuzhou 221006, China

[Abstract] Objective To evaluate the biological characteristics, phenotype of bone marrow mesenchymaI stem cells that are isolated. Methods Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated, purified and cultured by the whole bone marrow adherence method. Morphological observation and flow cytometry determination of celI surface markers were performed., Results The positive rates of BMSCs, CD34 and CD29 were 5, 91.16% and 94.27% in P3 cells cultured in CD90 generation. Conclusion The whole bone marrow adherence method is easy to operate, and can be used to harvest high-purification bone marrow mesenchymal stem cells with high cell viability and diferentiation ability.

[Key words]The whole bone marrow adherence method, Mesenchymal stern cells, Cultured

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.21.051

【文章編號】1674-9308（2015）21-0069-02

【文獻標識碼】B

【中圖分類號】R361