張文萍　甘夢月　馬妍妮　黨宏萬

[摘要] 目的 建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測定大鼠血漿中阿霉素的血藥濃度，并用于阿霉素載藥納米粒的體內(nèi)藥動學研究。 方法 色譜柱采用Shim-pack XR-ODS柱（2.0 mm×100 mm，2.2 μm），儀器采用API 4000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，采用多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）定量離子對為m/z544.2→m/z396.9（阿霉素）和m/z357.3→m/z133.8（吡格列酮，內(nèi)標）；甲醇沉淀蛋白法處理樣品。 結(jié)果 阿霉素在2.0～2000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為2.0 μg/L，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾阿霉素的測定；日內(nèi)和日間精密度RSD均小于±15.0%；阿霉素低、中、高3個QC濃度的提取回收率分別為（92.1±5.9）%、（82.8±2.9）%和（80.1±9.7）%，基質(zhì)效應分別為（91.1±2.4）%、（82.1±1.7）%和（81.2±2.5）%。 結(jié)論 該方法適用于阿霉素納米粒在大鼠體內(nèi)的藥物動力學研究。

[關(guān)鍵詞] 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；阿霉素；藥動學研究；含量測定

[中圖分類號] R969.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）12（b）-0055-05

阿霉素主要通過嵌入DNA而抑制核酸的合成，產(chǎn)生細胞毒性作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用[1]。由于心臟毒性較大，在實體瘤內(nèi)部滲透性差，臨床應用受到極大的限制[2-3]。由于納米給藥系統(tǒng)具有靶向性、緩釋性、降低藥物毒性和提高藥物穩(wěn)定性等特點，阿霉素的納米靶向傳遞是當前研究的熱點[4-5]。由于納米制劑給藥量小，需要建立靈敏、高效的體內(nèi)藥物濃度測定方法進行藥動學研究。目前，阿霉素的體內(nèi)測定方法主要有HPLC-UV[6]、熒光光度法[7-8]、HPLC-FLU[9-12]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）[13-15]等方法，以熒光檢測方法為主，液相-質(zhì)譜聯(lián)用法報道較少。其中HPLC-UV、熒光光度法和HPLC-FLU檢測靈敏度低，LC-MS/MS多采用液液萃取的提取方法，樣品處理較復雜，且血漿用量大，分析時間較長，且用于阿霉素納米制劑藥動學研究的較少。本文旨在建立一種簡便快速、專屬性強的LC-MS/MS法測定大鼠血漿中阿霉素的血藥濃度，并將其應用于阿霉素載藥納米粒的藥物動力學研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

API 4000串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國Applied Bio-systems公司），LC-30A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），Eppendorf AG5804R低溫高速離心機（德國Eppendorf公司），XW-80A渦旋混合器（姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司），梅特勒AE240電子天平（Mettler托利多儀器上海有限公司），Milli-Q ADVANTAGEA10純水儀（Merck Millipore公司），DW-86L628醫(yī)用低溫箱（青島海爾特種電器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸阿霉素（純度>98.89%，上海寶曼生物科技有限公司，批號20120715），鹽酸吡格列酮（含量質(zhì)量分數(shù)>99.55%，濟南中科一通化工有限公司，批號2011 0904），阿霉素載藥納米粒 （含量0.6 g/L，寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院臨床藥理研究室制備）。色譜甲醇、乙腈（美國Fisher公司）。

1.3 動物

6只SD大鼠，雄性，平均體重約為230 g，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號SCXK（寧）2011-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制及樣品處理

2.1.1 溶液配制 精密稱取鹽酸阿霉素10.7 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后并定容，配制相當于阿霉素濃度為1.00 g/L的溶液。用甲醇水（1∶1）稀釋濃度為2、4、10、20、100、400、1000、2000 μg/L系列標準溶液，以及濃度分別為5、80、1600 μg/L的質(zhì)量控制（QC）溶液，置于-4℃冰箱備用。

精密稱取鹽酸吡格列酮11.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后并定容，配制相當于吡格列酮濃度為1.00 g/L的溶液。取上述儲備液用甲醇水（1∶1）稀釋至濃度為15 μg/L的內(nèi)標溶液，置于-4℃冰箱備用。

2.1.2 血漿樣品處理 取大鼠血漿50 μL，置于1.5 mL EP管中，加入50 μL 15 μg/L吡格列酮溶液，50 μL甲醇水（1∶1），渦旋30 s，加入250 μL甲醇，渦旋2 min，4℃離心10 min（14 000 r/min），取上清液10 μL進樣。

2.2 測定條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：（Shim-pack XR-ODS（2.0 mm×100 mm，2.2 μm）；保護柱：Shim-pack GVP-ODS（2.0 mm×5 mm，2.2 μm）；流動相：A相（0.1%冰醋酸），B相（甲醇），采用梯度洗脫，0～0.2 min，40%B相；0.2～0.8 min，80%B相；0.8～3.0 min，80%B相；3.0～3.5 min，40%B相，4.0 min結(jié)束，流速為0.2 mL/min；柱溫40℃；進樣量10 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源：Turbo Spray；碰撞氣6 psi；氣簾氣10 psi；霧化氣60 psi；輔助加熱氣30 psi；離子噴霧電壓4000 V；離子源溫度350°C；去簇電壓56 V；Q0電壓10 V；碰撞能量15 V；碰撞池出口電位12 V。正離子模式檢測；MRM監(jiān)測。定量離子對為m/z 544.2→m/z 396.9（阿霉素）和m/z 357.3→m/z 133.8（吡格列酮，內(nèi)標），二級掃描質(zhì)譜圖見圖1。

2.3 分析方法確證

2.3.1 專屬性 分別取6種不同來源的大鼠空白血漿各50 μL，置于1.5 mL EP管中，其中以50 μL甲醇水（1∶1）代替內(nèi)標溶液，50 μL甲醇水（1∶1）代替阿霉素標準溶液體積，其余按照“2.1.2”項下方法操作，測定后為空白血漿樣品色譜圖（圖2A）。

取空白大鼠血漿50 μL，置于1.5 mL EP管中，將質(zhì)量濃度為2.0 μg/L的阿霉素標準溶液和內(nèi)標溶液（15 μg/L）加入空白血漿中，其余按照“2.1.2”項下方法操作，測定后為含藥血漿樣品色譜圖（圖2B）。其中，阿霉素和吡格列酮的保留時間分別約為2.58 min和3.19 min。

取大鼠給藥后4 h采集的血漿樣品，按照“2.1.2”項下方法操作，測定后為實際血漿樣品色譜圖（圖2C）。如圖所示，大鼠血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對阿霉素及吡格列酮測定無干擾，說明本方法專屬性良好。

2.3.2 標準曲線與定量范圍 取6 份空白大鼠血漿各50 μL，分別加入內(nèi)標溶液50 μL，再加入阿霉素系列標準溶液，制成阿霉素濃度為2、4、10、20、100、400、1000、2000 μg/L的含藥血漿樣品，按“2.1.2”項下處理后測定；以阿霉素濃度為橫坐標，阿霉素與內(nèi)標物的峰面積比值為縱坐標，得到典型回歸方程為：A=0.00528C-0.00593，r=0.9976。結(jié)果表明，阿霉素在2.0～2000 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為2.0 μg/L，可以滿足大鼠血漿中阿霉素濃度的測定。

2.3.3 精密度與準確度 取大鼠空白血漿50 μL，按照“2.3.2”項下方法制備濃度為2.0 μg/L的阿霉素定量下限樣品6份，按血漿樣品處理方法處理后測定，日內(nèi)精密度RSD為13.4%，準確度為-2.3%。

取大鼠空白血漿50 μL，按照“2.3.2”項下方法制備阿霉素濃度分別為5、80、1600 μg/L的QC樣品，每濃度平行制備6樣本，連續(xù)測定3 d，計算日內(nèi)、日間精密度與準確度，結(jié)果見表1。由表1可知本方法精密度與準確度良好。

2.3.4 提取回收率 提取樣品的制備（EX QC）：取6種不同來源的空白大鼠血漿50 μL，按“2.3.2”項下方法配制阿霉素濃度為5、80、1600 μg/L的QC樣品，每濃度平行制備6樣本，進樣分析，記錄相應的色譜峰面積。

未經(jīng)提取樣品的制備（NEX QC）：同時另取6種不同來源的大鼠空白血漿各50 μL，加入甲醇溶液250 μL，渦旋2 min，離心10 min（14 000 r/min），吸取上清液，加入5、80、1600 μg/L的QC溶液50 μL，內(nèi)標溶液50 μL，混勻，進樣分析，每濃度平行制備6樣本，記錄相應的色譜峰面積。

提取回收率計算：以每一濃度EX樣本測定所得的分析物峰面積除以NEX樣本測定所得的分析物峰面積，同一來源血漿一對一求比值，計算對3個QC濃度的分析物于6個不同來源的血漿基質(zhì)中的提取回收率，RSD應不大于15%；以EX樣本測定所得的內(nèi)標峰面積除以NEX樣本測定所得的內(nèi)標峰面積，同一QC濃度的同一來源血漿一對一求比值，計算對工作濃度的內(nèi)標的提取回收率，RSD應不大于15%。

阿霉素低、中、高3個QC濃度的提取回收率分別為（92.1±5.9）%、（82.8±2.9）%和（80.1±9.7）%，內(nèi)標提取回收率為（91.6±12.0）%，RSD均≤12.0%，結(jié)果可知提取回收率良好。

2.3.5 基質(zhì)效應 含有基質(zhì)樣品的制備：同“2.3.4”項下未經(jīng)提取樣品的制備方法操作。

無基質(zhì)樣品的制備（溶液W樣本）：取純水50 μL代替空白血漿，分別加入50 μL IS溶液、50 μL阿霉素濃度為5、80、1600 μg/L的QC標準溶液，再加入250 μL甲醇，每濃度各6樣本，渦流后測定，記錄相應的色譜峰面積。

基質(zhì)效應計算：以每一濃度NEX樣本測定所得的分析物峰面積除以W樣本測定所得的分析物平均峰面積，計算6個不同來源的血漿基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)對3個QC濃度的分析物的基質(zhì)效應，RSD應不大于15%；以NEX樣本測定所得的內(nèi)標峰面積除以W樣本測定所得的內(nèi)標平均峰面積，計算內(nèi)源性物質(zhì)對工作濃度的內(nèi)標的基質(zhì)效應，RSD應不大于15%。

阿霉素低、中、高3個QC濃度的基質(zhì)效應分別為（91.1±2.4）%、（82.1±1.7）%和（81.2±2.5）%，內(nèi)標基質(zhì)效應為（109.0±10.0）%，結(jié)果符合規(guī)定[16]。

2.3.6 穩(wěn)定性 按“2.3.2”項下方法分別配制阿霉素濃度為5、80和1600 μg/L的含藥血漿樣品，考察阿霉素血漿樣品在室溫放置12 h穩(wěn)定性、樣品處理后放置24 h穩(wěn)定性、-70℃ 3次凍融穩(wěn)定性以及-70℃長期放置30 d穩(wěn)定性。結(jié)果如表2所示，阿霉素在以上條件下穩(wěn)定性良好。

2.4 生物樣品測定

2.4.1 給藥方案及血漿樣品采集 6只健康SD大鼠，雄性，平均體重約為230 g，分別尾靜脈注射阿霉素載藥納米粒，給藥劑量為5 mg/kg。給藥后分別在0.087、0.167、0.25、0.33、0.5、1、2、4、6、10、24、48、72 h眼眶取血0.5 mL，取血后立即移入經(jīng)肝素處理的試管中，4℃離心10 min（14 000 r/min），分離血漿，于-70℃冰箱中冷凍，待分析。

2.4.2 血漿樣品測定 血漿樣品的處理按照“2.1.2”項下方法進行，根據(jù)當日標準曲線，計算各時間點血漿中阿霉素的濃度，同時測定濃度為5、80、1600 μg/L的QC樣品。血藥濃度-時間曲線如圖3所示。

2.4.3 藥物動力學參數(shù)計算 采用DAS 3.0藥動學軟件處理，非隔室模型法計算阿霉素載藥納米粒注射后的主要藥動學參數(shù)。其中AUC0-t為（2585±273）μg·h/L，AUC0-∞為（2854±240）μg·h/L，ke為（0.03±0.01）/h，t1/2為（28.40±7.27）h，tmax為（0.08±0.00）h，V為（71.87±18.07）L/kg，血漿清除率為（1.76±0.15）L/（h·kg），Cmax為（3253±968）μg/L。

3 討論

3.1 液相條件的考察

有機相為甲醇時，阿霉素的響應比用乙腈時高約1.5倍；水相為0.1%冰醋酸時，阿霉素的響應比0.1%甲酸高約1.2倍；采用梯度洗脫時，阿霉素和內(nèi)標的峰形良好，無拖尾。最終確定以甲醇-0.1%冰醋酸作為水相，甲醇作為有機相，梯度洗脫。

3.2 測定方法的比較

文獻中雖然已有LS-MS/MS法測定阿霉素體內(nèi)濃度的報道[13-15]，但多采用氯仿-甲醇（4∶1）和乙酸乙酯進行液液萃取，樣品處理較復雜，且血漿用量大，本研究只需要大鼠血漿50 μL，文獻中分別使用200 μL和400 μL，是本研究的4倍和8倍。雖然定量下限最低可以達到1.0 μg/L，但血漿樣品處理方法比較復雜，采用乙腈沉淀蛋白后，將上清液取出用氮氣吹干，再用流動相復溶，靈敏度雖高，但制樣過程時間較長；同時，阿霉素的出峰時間為4.9 min，約為本研究的2倍。本研究采用甲醇直接沉淀蛋白，處理方法簡單，阿霉素在給藥后2.58 min左右出峰，大大縮短了分析時間。

本研究建立的大鼠血漿中阿霉素濃度測定的LC-MS/MS法，樣品處理方法簡單、專屬性強、分析時間快，能夠滿足阿霉素納米粒在大鼠體內(nèi)的藥動學研究。

[參考文獻]

[1] Siurala M，Bramante S，Vassilev L，et al. Oncolytic adenovirus and doxorubicin-based chemotherapy results in synergistic antitumor activity against soft-tissue sarcoma [J]. Int J Cancer，2014，Epub ahead of print.

[2] Vejpongsa P，Yeh ET. Prevention of anthracycline-induced cardiotoxicity： challenges and opportunities [J]. J Am Coll Cardiol，2014，64（9）：938-945.

[3] Ta T，Bartolak-Suki E，Park EJ，et al. Localized delivery of doxorubicin in vivo from polymer-modified thermosensitive liposomes with MR-guided focused ultrasound-mediated heating [J]. J Control Release，2014，194C：71-81.

[4] Wang B，F(xiàn)eng D，Han L，et al. Combination of apolipoprotein A1-Modi Liposome-Doxorubicin with autophagy inhibitors overcame drug resistance in vitro [J]. J Pharm Sci，2014，Epub ahead of print.

[5] Deng H，Liu J，Zhao X，et al. PEG-b-PCL copolymer micelles with the ability of pH-controlled negative-to-positive charge reversal for intracellular delivery of doxorubicin [J]. Bioma cromolecules，2014，Epub ahead of print.

[6] 童珊珊，余江南，徐希明，等.反相高效液相色譜法測定阿霉素在小鼠血清中的含量[J].江蘇大學學報：醫(yī)學版，2002，12（6）：563-565.

[7] 閆繼東，辛華，鄭雅娟，等.應用熒光分光光度法測定血清及組織中阿霉素含量[J].中國實驗診斷學，2007，11（5）：596-597.

[8] 馬玉彥，陳晾，石于波，等.熒光分光光度法測定人血清中阿霉素含量的方法研究[J].實用腫瘤學雜志，1994，3：319-320.

[9] 張宏文，錢立新，王蔚青，等.反相高效液相色譜熒光檢測法測定血漿及膀胱中阿霉素的濃度[J].江蘇藥學與臨床研究，2006，14（1）：4-5.

[10] 文旭，范健，繆玉山.大鼠血漿及組織中阿霉素含量測定方法（HPLC內(nèi)標法）的建立[J].南京鐵道醫(yī)學院學報，2001，20（2）：77-79.

[11] 徐小薇，付強，李大魁，等.HPLC測定兔血漿及淋巴組織中的阿霉素[J].南京鐵道醫(yī)學院學報，1996，31（2）：97-99.

[12] 何素梅，魏樹禮，吳傳斌，等.反相高效液相色譜熒光檢測法測定血漿或肝組織中阿霉素含量[J].藥物分析雜志，1994，14（4）：8-11.

[13] 陳思明，金藝，喬明曦，等.大鼠血漿中阿霉素HPLC-MS/MS測定法及其在藥動學中的應用[J].沈陽藥科大學學報，2012，29（3）：199-202.

[14] 劉奕明，林愛華，鄧時貴，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定兔血漿阿霉素濃度[J].藥物分析雜志，2009，29（8）：1282-1286.

[15] 祝春來，張邦樂，宦夢蕾，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定大鼠血漿中阿霉素和塞來昔布[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2009，9（22）：4222-4225.

[16] Surenra B，Anthoy D. Key elements of bioanalytical method validation for small molecules [J]. The AAPS Journal，2007， 9（1）：E109-E114.

（收稿日期：2014-08-10 本文編輯：程 銘）