馬國棟 梁偉鈞（通訊作者）524000廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科

基因修飾內(nèi)皮祖細胞在冠心病治療中的研究進展

馬國棟 梁偉鈞（通訊作者）
524000廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科

冠心病的發(fā)病機制復雜，其中一個重要的發(fā)病機制是冠狀動脈內(nèi)皮損傷和修復兩者間的平衡受到破壞。目前關于冠心病治療方法主要包括藥物治療、冠脈搭橋、支架介入等。內(nèi)皮祖細胞在一定條件下能分化為內(nèi)皮細胞，參與血管新生。但是內(nèi)皮祖細胞在人體組織中含量極低，遠不夠為移植治療所用。另外，有多項研究顯示，年齡大、冠心病、糖尿病、高血壓患者的內(nèi)皮祖細胞相比正常者量更少，且其功能顯著下降。近年有許多學者提出通過基因修飾的內(nèi)皮祖細胞能解決上述問題。下面筆者為基因修飾內(nèi)皮祖細胞移植治療的研究予以綜述，為臨床治療冠心病提供新思路。

冠心病；內(nèi)皮祖細胞；基因修飾

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary atherosclerotic heart disease）又稱冠心病，是指冠狀動脈粥樣硬化使管腔狹窄或阻塞導致心肌缺血缺氧而引起的心臟病，其中一個重要的發(fā)病機制是冠脈內(nèi)皮損傷和修復兩者間的平衡受到破壞。目前關于冠心病治療方法主要包括藥物治療、冠脈搭橋、支架介入等，這些方法雖可使閉塞的血管再通，但并不能挽救微小血管的損害，同時還有心肌缺血再灌注損傷的風險。這迫使人們?nèi)ふ乙粋€更好的方法來治療冠心病。內(nèi)皮祖細胞是成體干細胞中的一種，在一定條件下能分化為內(nèi)皮細胞，參與血管新生。但是內(nèi)皮祖細胞在人體組織中含量極低，遠不夠為移植治療所用。另外，有多項研究顯示，年紀大、冠心病、糖尿病、高血壓患者的內(nèi)皮祖細胞相比正常人數(shù)量更少，而且其功能顯著下降。近年有許多學者提出通過基因修飾的內(nèi)皮祖細胞能解決上述問題。下面筆者為基因修飾內(nèi)皮祖細胞移植治療的研究予以綜述，為臨床治療冠心病提供新思路。

內(nèi)皮祖細胞概要

內(nèi)皮祖細胞（Endothelial progenitor cell，EPCs），是成體干細胞中的一種，在一定條件下可分化為內(nèi)皮細胞且具有內(nèi)皮細胞功能。1997年，Asahara等首次證明了外周血中存在能在體外增殖、遷移并分化為內(nèi)皮細胞的EPCs[1]。隨著對EPCs進一步研究證實，它主要來源于骨髓與臍帶血中，而外周血中只有極少量分布。2004年，Hur等發(fā)現(xiàn)人外周血中存在兩種不同類型的EPCs，即早期EPCs和晚期EPCs[2]。早期EPCs是指在體外培養(yǎng)3～5d后出現(xiàn)的梭形細胞，主要參與機體血液系統(tǒng)的發(fā)育及炎性免疫應答，而沒有形成血管的功能；EPCs是指體外培養(yǎng)2周后出現(xiàn)的鋪路石樣細胞，它具有細胞增殖、遷移、粘連及在基底膜基質上形成血管的能力。因其EPCs不具備內(nèi)皮細胞的功能，且不具有增殖能力，不能傳代培養(yǎng)，所以早期EPCs不是真正意義上的EPCs。而晚期EPCs能分化為內(nèi)皮細胞且具有內(nèi)皮細胞的功能，是真正意義的EPCs。

內(nèi)皮祖細胞的鑒定

目前國際上比較認可的是采用免疫細胞法與雙熒光染色法的共同鑒定EPCs。免疫細胞法主要有兩種，一種是免疫磁珠法，另一種是流式細胞分選法。這兩種方法各有優(yōu)劣，但共同點都是通過檢測細胞表面的特有抗原標記物，如KDR+、CD133+、CD34+等。雖然以上細胞表面標志物為鑒定EPCs的經(jīng)典標記物，但是這些標記物并不具有特異性。KDR主要存在于分化成熟且參與血管新生的內(nèi)皮細胞表面，同時它在來源于內(nèi)胚層的肝祖細胞的表面也有表達。而CD34主要表達于骨髓來源的造血干細胞表面，其在介導細胞間黏附作用中起到重要作用。CD133是造血干細胞的表面標記物，它能表達于人臍帶血來源CD34-造血干細胞的表面。同時它還能在EPCs表面表達，但不能表達于成熟的內(nèi)皮細胞表面。故一般用同時表達KDR+、CD133+、CD34+這三種特有標記物來共同鑒定EPCs。雙熒光染色法是應用EPCs具有吞噬DiI-Ac-LDL，結合FITC-UEA-1的特性，通過熒光顯微鏡觀察到，EPCs吞噬DiI-Ac-LDL而在細胞漿中呈現(xiàn)紅色熒光，EPCs結合FITC-UEA-1而在細胞膜上呈現(xiàn)綠色熒光[3]。

內(nèi)皮祖細胞與血管新生

血管新生（angiogenesis）是指在機體中內(nèi)皮祖細胞遷移、增殖、管腔形成并發(fā)展成一個有血流供應系統(tǒng)的過程。多項研究表明，EPCs的增殖、動員、募集在血管新生機制中起到至關重要的作用。有研究表明當機體血管受損、組織缺血缺氧時，骨髓EPCs會動員到外周血中，通過定向靶位作用遷移到缺血區(qū)域，參與血管新生[4]。雖然這其中機制尚未明確，但多位學者研究表明，EPC相關細胞因子如血管內(nèi)皮生長因子、基質細胞衍生因子、堿性成纖維生長因子在其中發(fā)揮著重要作用。

EPCs移植治療局限性與新思路

雖然上述移植EPCs治療冠心病已經(jīng)被多項研究支持其可行性，但是EPCs在人體組織中含量極低，遠不夠為移植治療所用。另外有多項研究顯示，年紀大、冠心病、糖尿病、高血壓患者的內(nèi)皮祖細胞相比正常者數(shù)量更少，而且其功能顯著下降。為了解決上述問題，最近很多學者提出通過對EPCs基因修飾來提高EPCs的增殖、血管再生能力，從而來克服上述提到的困難，并經(jīng)多項實驗研究證明其可行性。

端粒酶逆轉錄酶基因：端粒酶逆轉錄 酶 （The telomeras rever transcriptase TERT）是調(diào)節(jié)細胞生命周期的關鍵酶，其通過催化修飾端粒酶來提高端粒酶的活性來維持端粒的穩(wěn)定性，從而抑制細胞衰老或凋亡。2002年，Murasawa等通過將轉染hTERT的EPCs應用于后肢循環(huán)缺血的大鼠模型中[5]，21 d后發(fā)現(xiàn)轉染hTERT基因的EPCs的增殖、遷移、抗衰老、再生血管能力較對照組有明顯增強。2012年，Shuai等通過將轉染hTERT基因的EPCs移植于5/6腎臟切除的大鼠模型中，12周后發(fā)現(xiàn)其能減少腎間質纖維化、增大毛細血管密度來提高腎功能[6]。這為我們用TERT基因修飾EPC治療冠心病提供理論依據(jù)。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因：研究表明內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS）是血管內(nèi)皮合成一氧化氮（NO）的關鍵酶，其催化內(nèi)皮細胞生成的NO為脂溶性的，能很快從細胞膜滲透于平滑肌細胞，使其松弛，達到擴張血管調(diào)節(jié)血管張力，同時也能滲透進入血小板，使血小板活性降低，抑制其凝集和向血管內(nèi)皮的黏附，從而防止血栓的形成，防止動脈粥樣硬化的發(fā)生，在維持正常血管功能中起到重要作用。最近有研究表明，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、促紅細胞生成素、他汀類藥物、雌二醇等能增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的分泌，從而促進EPCs遷移及提高損傷血管再內(nèi)皮化能力，而采用eNOS基因敲除或NOS抑制劑能抑制EPCs修復血管內(nèi)皮的功能。2014年，催等將經(jīng)eNOS基因轉染的EPCs經(jīng)尾靜脈途徑作用于頸動脈內(nèi)皮受損的大鼠模型中，14 d后發(fā)現(xiàn)轉染eNOS基因組較對照組，管內(nèi)膜的抗增生及改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能明顯增強[7]。

人組織型激肽釋放酶基因：人組織型激肽釋放酶（Human Tissue kallikrein，hTK）為激肽釋放酶（kallikrein，KLK）中的一員，是激肽系統(tǒng)的關鍵酶，主要存在于胰腺、腎臟、血管等組織中，其能將低分子量激肽原（LMWK）轉化為具有舒張血管、抑制心肌重構、抑制平滑肌增生及缺血再灌注損傷的保護作用的緩激肽。2013年Fu等將轉染hTK-162基因的EPCs作用于后肢缺血的大鼠中[8]，21 d后發(fā)現(xiàn)轉染hTK-162基因的EPCs組較對照組，其后肢缺血周邊帶的毛細血管密度及血流灌注量增加。這說明通過hTK基因的轉染能增強EPCs血管再生能力。同年，Yao等將轉染hTK基因的EPCs應用于急性心肌梗死小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)hTK基因的過表達能增加梗死周邊帶毛細血管密度、抑制心肌細胞凋亡及增強左室射血功能[9]。這說明通過hTK基因的轉染能增強EPCs血管再生功能，這表明經(jīng)hTK基因轉染的EPCs在治療缺血性疾病中具有巨大的潛力。

蛋白激酶B與血紅素氧合酶-1：蛋白激酶B（protein kinase B）又稱AKT，是磷酸肌醇在細胞膜中被激活的一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，其在血管新生與維持血管功能中有著重要作用。2005年，Ackah等通過下調(diào)EPCs中AKT的表達，發(fā)現(xiàn)EPCs的遷移能力及一氧化氮生物活性降低，最終導致后肢缺血小鼠模型梗死部位的加重[10]。血紅素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1，HO-1）是血紅素降解的關鍵酶，在血管新生的機制中起到關鍵作用。2007年，Deshane等發(fā)現(xiàn)HO-1基因敲除的小鼠中，EPCs的遷移能力及成血管功能會嚴重受損[11]。基于這兩種酶在血管新生的特性，2012年，Brunt等通過EPCs過表達Akt與HO-1，發(fā)現(xiàn)EPCs的遷移、黏附及新生血管能力得到提高，從而增強了EPCs在治療缺血性疾病的作用[12]。

展望

目前國內(nèi)外已報道了多篇關于基因修飾EPCs治療缺血性疾病的研究，其中修飾的基因的種類是多種多樣的，也都顯示其能增強EPCs某方面的功能，證明經(jīng)基因修飾EPCs治療缺血性疾病的效果要優(yōu)于單純EPCs移植。但是關于基因修飾EPCs移植治療的研究目前只限于小規(guī)模的動物實驗中。要充分評估這種新穎的治療方法的安全性和臨床應用于冠心病患者的有效性還有很長的路要走。但經(jīng)上述關于基因修飾EPCs的研究論證，我們有理由相信，基因修飾EPCs移植治療是個很有潛力的方法，能為臨床治療冠心病提供一個全新的途徑。

[1]Asahara T,Murohara T,Sullivan A,etal.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275（5302）：964-967.

[2]Hur J,Yoon CH,Kim HS,et al.Characterization of Two Types of Endothelial Progenitor Cells and Their Different Contributions to Neovasculogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24（2）：288-293.

[3]李嵐,姚玉宇,馬根山.芎嗪對體外血管內(nèi)皮祖細胞氧化損傷的保護作用[J].東南大學學報,醫(yī)學版,2009,28（3）：180-184.

[4]Steiner S,Niesaner A,Ziegler S,et al.Endurance training increases thenumber of endothelia progenitor cells in patients with cardiovascular riskand coronary artery disease [J].Athereselerosis,2005,181：305-310.

[5]Murasawa S,Llevadot J,SilverM,etal.Constitutive human telomerase reverse transcriptase expression enhances regenerative properties of endothelial progenitor cells[J].Circulation,2002,106（9）：1133-1139.

[6]Shuai L,Li X,He Q,et al.Angiogenic effectof endothelial progenitor cells transfected with telomerase reverse transcriptase on peritubularmicrovessel in five out of six subtotal nephrectomy rats[J].Ren Fail.2012,34（10）：1270-1280.

[7]Cui B,Huang L,Fang Y,et al.Transplantation of endothelial progenitor cells overexpressingendothelialnitric oxide synthaseenhances inhibition of neointimal hyperplasia and restores endothelium-dependent vasodilatation[J].Microvasc Res,2011,81（1）：143-150.

[8]Shen Shen Fu,Fu Ji Li,Yuan Yuan Wang,et al.Kallikrein Gene-Modified EPCs Induce Angiogenesis in Rats with Ischemic Hindlim lb and Correlatewith Integrin avβ3 Expression[J].PLoSOne,2013,8（9）：730.

[9]Yuyu Yao,Zulong Sheng,Yefei Li,et al.Tissue Kallikrein-modified human endothelial progenitor cell implantation improves cardiac function via enhanced activation of akt and increased angiogenesis[J].Laboratory Investigation,2013,93：577-591.

[10]Ackah E,Yu J,Zoellner S,et al.Akt1/protein kinase Balpha is critical for ischemic and VEGF-mediatedangiogenesis[J].J Clin Invest,2005,115：2119-2127.

[11]Deshane J,Chen S,Caballero S,et al.Stromal cell-derived fator1 promotes angiogenesis via a heme oxygenase1 dependent mechanism[J].JExp Med,2007,204：605-618.

[12]Brunt KR,Wu J.Ex vivo Akt/HO-1 gene therapy to human endothelial progenitor cells enhancesmyocardial infarction recovery[J].Cell Transplant,2012,21（7）：1443-1461.

Research progressofgenemodified endothelialprogenitor cells in the treatmentof coronary heart disease

Ma Guodong,LiangWeijun（Correspondingauthor）
InternalMedicine-CardiovascularDepartment,the Affiliated HospitalofGuangdongMedicalCollege 524000

Foundation item guangdong province science and technology plan project（00300200135561018）

The pathogenesis of coronary heart disease is complex,one of the important pathogenesis is the imbalance in the coronary endothelial injury and repair.Currently,treatmentof coronary heartdiseasemainly includes drug therapy,coronary artery bypass graft,bracket intervention and so on.Endothelial progenitor cells can differentiate into endothelial cells under certain conditions,to participate in angiogenesis.But the contentof endothelial progenitor cells is very low in human tissues,it is far from enough for transplantation.In addition,several studies have shown that,compared with normal person,endothelial progenitor cells in patients with old age,diabetes,hypertension,coronary heart disease is less,and its function is significantly decreased.In recent years,many scholars put forward thatgenemodified endothelial progenitor cells can solve the above problems.The author reviews the research ofgenesmodified endothelial progenitor cells transplantation treatment,to provide new ideas for clinical treatmentof coronary heartdisease.

Coronaryheartdisease；Endothelialprogenitor cells；Genemodification

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.20.1

廣東省科技計劃項目（00300200135561018）