賈佩，肖紅衛(wèi)，劉西梅，鄭新民，許生成，張立蘋

摘要：試驗比較了幾種不同化學激活方法[試驗Ⅰ：不同濃度乙醇溶液作用不同時間+2 mmol/L 6-二甲基氨基嘌呤溶液（6-DMAP）作用4 h對豬體外成熟卵母細胞進行激活處理;試驗Ⅱ：不同濃度離子霉素作用不同時間+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h對豬體外成熟卵母細胞進行激活處理]對豬體外成熟卵母細胞孤雌激活效率的影響。結(jié)果表明，10%的乙醇溶液作用10 min+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h及10 μmol/L的離子霉素作用10 min+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h可獲得較高的囊胚率，其囊胚率分別為16.09%、13.24%。

關(guān)鍵詞：豬;卵母細胞;孤雌激活

中圖分類號：S828.3 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5802-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.045

卵母細胞的人工激活是核移植供體細胞核基因組重新編程，啟動核移植胚正常發(fā)育的重要環(huán)節(jié)[1]，同時也是提高胞質(zhì)內(nèi)單精注射效果的重要措施[2]。卵母細胞的激活方法有很多種，一般可分為物理激活法（電脈沖、機械刺激、溫度變化等）和化學激活法（鈣離子載體A23187、離子霉素、氯化鍶、乙醇、放線菌酮、蛋白合成抑制劑等）。孤雌激活方法對激活效率的影響較大，離子霉素和乙醇是常用的人工激活劑，用于哺乳動物體外成熟卵母細胞的孤雌激活。本研究著重探討了離子霉素和乙醇結(jié)合蛋白激酶抑制劑6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）對體外成熟卵母細胞孤雌激活的影響，以期獲得在本實驗室條件下較優(yōu)的化學孤雌激活方法，為胚胎培養(yǎng)體系的建立和體細胞核移植技術(shù)的研究提供必要的方法和手段。

1 ?材料與方法

1.1 ?成熟培養(yǎng)液基礎(chǔ)液配制及各種試劑來源

成熟培養(yǎng)液的基礎(chǔ)液成分如下：TCM-199（Gibco）添加3.05 mmol/L葡萄糖、0.91 mmol/L丙酮酸鈉、0.57 mmol/L L-半胱氨酸、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL的硫酸鏈霉素、10%（V/V）卵泡液、10 IU/mL孕馬血清促性腺激素（PMSG）和10 IU/mL人絨毛膜促性腺激素（hCG）;DPBS購自Gibco公司。本試驗中所有化學試劑及生物試劑除特殊標明外均購自Sigma公司。

1.2 ?豬卵巢及卵丘-卵母細胞復合體（Cumulus-oocyte complexes，COCs）的收集

從屠宰場摘取經(jīng)產(chǎn)母豬卵巢，立即放入添加雙抗的35 ℃滅菌生理鹽水中2～4 h內(nèi)送回實驗室。卵巢組織用滅菌且預熱的生理鹽水清洗3次，然后用帶標準20號針頭的無菌注射器（內(nèi)有少量平衡后的DPBS）抽取卵巢表面直徑為3～8 mm的卵泡，抽取液注入50 mL尖底離心管中，置于39 ℃的水浴鍋中。待COCs沉淀后，用DPBS洗滌2次，后在立體顯微鏡下檢卵。A級：卵丘細胞在3層或3層以上。B級：卵丘細胞為1～2層;或卵丘細胞雖在3層或3層以上，但是不完整，部分為1～2層。C級：裸卵或卵丘細胞雖為1～2層或多層，但是不完整，部分裸露。本試驗取A級及B級COCs用于成熟培養(yǎng)。

1.3 ?卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)

檢出的COCs用添加雙抗（10 IU/mL）的DPBS洗滌3次，然后用成熟培養(yǎng)液洗滌3次，最后按試驗設計分別移入含有成熟培養(yǎng)液的五孔板中，每孔100枚。含成熟培養(yǎng)液的五孔培養(yǎng)板預先在CO2培養(yǎng)箱中平衡2 h以上。成熟培養(yǎng)條件為39 ℃、5%的CO2與飽和濕度。

1.4 ?豬卵泡液的制備

用帶有標準20號針頭的5 mL注射器抽吸直徑3～8 mm卵泡中的卵泡液，3 000 r/min離心30 min，0. 22 μm微孔濾膜過濾，分裝，-20 ℃凍存。

1.5 ?卵母細胞的孤雌激活及孤雌激活胚胎的培養(yǎng)

將成熟培養(yǎng)44 h的COCs移入含0.1%透明質(zhì)酸酶的無鈣鎂離子的DPBS中消化除去卵丘細胞，按照試驗設計進行激活處理，激活后用胚胎培養(yǎng)液NCSU-23洗滌3次后放入預先平衡好的NCSU-23微滴中進行胚胎培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為39 ℃、5%的CO2與飽和濕度。每48 h觀察一次， 分別統(tǒng)計其卵裂率和囊胚率。

1.6 ?試驗設計

1）考察不同濃度（9%、10%）的乙醇溶液作用不同時間（8、10、13、15 min）+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h對豬體外成熟卵母細胞孤雌激活的影響。將成熟的卵母細胞用操作液洗滌 3 次，再用不同濃度（9%、10%） 的乙醇溶液迅速洗滌 3 遍，分別用不同濃度（ 9%、10%）的乙醇溶液作用 8、10、13、15 min 后，移入 2 mmol/L 的 6-DMAP 中作用4 h，然后移入 NCSU-23中培養(yǎng)。每 48 h 觀察一次，記錄其卵裂率和囊胚率。

2）考察不同濃度（5、10、15 μmol/L）離子霉素作用不同時間（10、20、30、40 min）+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h對豬體外成熟卵母細胞孤雌激活的影響。將成熟的卵母細胞用操作液洗滌 3 次，再分別用不同濃度（5、10、15 μmol/L）離子霉素洗滌 3 遍，分別用不同濃度（5、10、15 μmol/L）離子霉素作用 10、20、30、40 min 后，移入 2 mmol/L 的 6-DMAP 中作用4 h，然后移入 NCSU-23中培養(yǎng)。每 48 h 觀察一次，記錄其卵裂率和囊胚率。

1.7 ?數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復3次以上，數(shù)據(jù)采用？字2檢驗。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同濃度的乙醇溶液作用不同時間對豬體外成熟卵母細胞孤雌激活的影響

由表1、表2可見，9%乙醇溶液進行處理時，作用10 min獲得的囊胚率最高，顯著（P<0.05）高于8 min和15 min處理組;10%的乙醇溶液進行處理時，處理10 min獲得的囊胚率最高，顯著（P<0.05）高于其他處理組。綜合來看，從胚胎后續(xù)發(fā)育的結(jié)果而言，10%的乙醇溶液作用10 min+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h對豬體外成熟卵母細胞的激活效果最好，其囊胚率為16.09%。

2.2 ?不同濃度離子霉素作用不同時間對豬體外成熟卵母細胞孤雌激活的影響

由表3、表4、表5可見，5 μmol/L的離子霉素各處理組間囊胚率差異不顯著;10 μmol/L的離子霉素各處理組中，作用10 min的處理組的囊胚率顯著（P<0.05）高于其他處理組;15 μmol/L的離子霉素各處理組中，作用20 min和30 min的處理組的囊胚率顯著（P<0.05）高于其他處理組。綜合來看，從胚胎后續(xù)發(fā)育的結(jié)果而言，10 μmol/L的離子霉素作用10 min+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h對豬體外成熟卵母細胞的激活效果最好，其囊胚率為 13.24%。

3 ?小結(jié)與討論

乙醇對卵母細胞的激活主要是通過水解細胞膜上PIP，產(chǎn)生IP。IP誘發(fā)細胞內(nèi)源鈣釋放到細胞質(zhì)中，提高了胞內(nèi)的游離鈣離子濃度來實現(xiàn)激活卵母細胞[3]，而離子霉素對卵母細胞的激活作用主要是通過動員細胞內(nèi)的Ca2+，依次觸發(fā)Ca2+內(nèi)流而引起細胞內(nèi)Ca2+濃度升高[4]，兩者的激活機理有所不同。6-DMAP則是通過影響MAPK和MPF的活性來激活卵母細胞[5]，它能夠抑制成熟促進因子和細胞靜止因子的活性，同時也抑制第二極體的排放，保證孤雌激活卵母細胞的染色體為二倍體[6]。由于二倍體的孤雌胚胎比單倍體的孤雌胚胎發(fā)育能力強，因此，為提高牛、兔等動物卵母細胞的激活效率，常用離子霉素、乙醇、電脈沖等與CHX、6-DMAP聯(lián)合激活[7]。

大量研究表明，用7%～8%的乙醇作用5～7 min可獲得較好的卵裂率，隨作用時間的延長激活率呈降低趨勢。劉國世等[8]用不同方法對豬卵母細胞進行激活，乙醇激活組中以9%乙醇溶液激活處理3 min效果最佳;Yi等[9]用8%乙醇溶液處理10 min 獲得最為理想的豬卵母細胞激活效果;趙金鳳[10]用乙醇處理豬卵母細胞后，移入 2 mmol/L 的 6-DMAP 中處理4 h，結(jié)果顯示9%乙醇溶液作用10、20 min 后孤雌胚的卵裂率和囊胚率均顯著高于其他處理組。本研究結(jié)果顯示，10%乙醇溶液作用10 min+2 mmol/L 6-DMAP處理4 h能獲得較好的囊胚率（16.09%），這與趙金鳳[11]的試驗結(jié)果一致，但與其他學者的報告結(jié)果不一致。乙醇的純度決定了乙醇激活的不穩(wěn)定性，卵母細胞的質(zhì)量和試驗季節(jié)也會造成試驗結(jié)果的差異。

國外有報道稱低濃度離子霉素（如5 μmol/L）短時間作用效果較好，當離子霉素濃度較高時短時間作用效果明顯，作用時間達30 min后其卵裂率和囊胚率下降，這可能與高濃度離子霉素的毒性有關(guān)。Betthauser等[11]采用15 μmol/L的離子霉素20 min，1.9 mmol/L 6-DMAP 處理3～4 h的化學激活方法，獲得了2窩4頭克隆豬。劉國世等[8]認為，15 μmol/L的離子霉素作用40 min+2.0 mmol/L 6-DMAP處理3～4 h的激活效率較好。趙金鳳[10]研究表明，5 μmol/L和10 μmol/L的離子霉素作用20 min均能獲得較高的卵裂率。喬利敏等[12]比較了不同濃度離子霉素對牛卵母細胞的激活效率，結(jié)果表明，10 μmol/L的離子霉素作用10 min能獲得較優(yōu)的卵裂率和囊胚率。本試驗研究結(jié)果顯示，10 μmol/L的離子霉素作用10 min+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h可獲得較高的囊胚率（13.24%）。此結(jié)果與上述諸學者結(jié)果稍有不同。影響卵母細胞孤雌激活效率的因素很多，如卵母細胞成熟質(zhì)量、實驗室條件、試驗季節(jié)等。

本研究比較了豬卵母細胞化學激活的試驗參數(shù)，為克隆轉(zhuǎn)基因動物及胚胎早期發(fā)育的發(fā)生機制、基因印記等研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] KIKYO N， WOLFFE ?A ?P. Reprogramming nuclei： insight from cloning， nuclear transfer ?and ?heterokaryons[J]. J Cell Sci，2000，113：11-20.

[2] CHEN S H，SEIDEL G E. Effects of oocyte activation and treatments of spermatozoa on embryonic development following intracytoplasmic sperm injection in cattle[J]. Theriogenology，1997，48：1265-1273.

[3] 烏云其其格，李向臣，躍 ?華，等.不同哺乳動物卵母細胞孤雌激活的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)學報，2008，35（9）：55-58.

[4] MORGAN A J， JACOB R. Ionomycin enhances Ca2+ influx by stimulating stor-regulated Cation entry and not by a direct action at the plasma membrane[J]. Biochemical Journal，1994， 300： 665-672.

[5] PRATHER R S， EICHEN P A， NICKS D K， et al. Artificial activation of porcine oocytes matured in vitro[J]. Molecular Reproduction Development，1991， 28： 405-409.

[6] MACHATY Z， WANG W H， DAY B N， et al. Complete activation of porcine oocytes induced by the sulfhydryl reagent， thimerosal[J]. Biology of Reproduction， 1997， 57： 1123-1127.

[7] MACHATY Z， PRATHER R S. Strategies for activation nuclear transfer oocytes[J]. Reproduction， Fertility and Development，1998，10：599-613.

[8] 劉國世，曾申明，吳中紅，等.不同激活方法對豬體外成熟卵母細胞孤雌發(fā)育的影響[J]畜牧獸醫(yī)學報，2004，35（6），615-620.

[9] YI Y J ，PARK C S. Parthenogenetic development of porcine oocytes t reated by ethanol ，cycloheximide ，cytochalasin B and 6-dimethylaminopurine [J] . Anim Reprod Sci ，2005 ，86（3-4）：297-304.

[10] 趙金鳳.豬卵母細胞孤雌激活方法的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2010.

[11] BETTHAUSER J，F(xiàn)ORSBERG E，AUGENSTEIN M，et al.Production of cloned pigs from in vitro systems[J].Nature biotechnology，2000，18：1055-1059.

[12] 喬利敏，喬富強，姚 ?華，等.不同化學激活方法及卵丘細胞層數(shù)對牛體外成熟卵母細胞孤雌發(fā)育的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2011，23（4）：692-697.