陳清嬋，簡清梅*，王勁松，孫愛紅，李蓉

（荊楚理工學院生物工程學院，湖北荊門448000）

從自然發(fā)酵小麥醬中篩選曲霉及制曲工藝研究

陳清嬋，簡清梅*，王勁松，孫愛紅，李蓉

（荊楚理工學院生物工程學院，湖北荊門448000）

從自然發(fā)酵的小麥醬中分離得到4株黃曲霉（Aspergillus flavus）和2株黑曲霉（Aspergillus niger），對其進行生理效價分析，結果表明，黃曲霉4號產(chǎn)糖化型淀粉酶和蛋白酶能力最強，且具有較強的產(chǎn)α-淀粉酶和酯化酶的能力，適合作為小麥醬制曲的發(fā)酵菌株。對其制曲工藝進行優(yōu)化，結果表明，在接種量為4%，制曲溫度為32℃，制曲時間為70 h的條件下，小麥曲的蛋白酶酶活力為549 U/g，較自然發(fā)酵制曲的481 U/g有較大提高。

小麥醬；曲霉菌種；制曲

小麥醬作為我國廣大農(nóng)村一種傳統(tǒng)的調(diào)味品，是以小麥為主要原料生產(chǎn)的醬類，一直以來由傳統(tǒng)家庭式自然發(fā)酵方法生產(chǎn)，成品香氣濃郁，風味俱佳，可代替醬油使用，且具有一定的保健功能，深受人們喜愛[1]?，F(xiàn)今，市面上銷售醬制品主要以面醬[2-3]、黃豆醬[4]、豆瓣醬[5]、豆豉[6]為主，且對這些醬品的菌相分析和加工工藝都已進行過廣泛研究。而小麥醬在市面少見，且相關研究較少。對小麥醬實行規(guī)?；a(chǎn)，具備良好的經(jīng)濟效益與社會效益。

發(fā)酵劑的優(yōu)劣對發(fā)酵產(chǎn)品色澤、風味、口感等品質的影響尤其重要，故優(yōu)良的醬類發(fā)酵劑應該來自于自然發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)質醬產(chǎn)品[7]。對于小麥醬而言亦是如此，較優(yōu)良的發(fā)酵劑菌種對于研究小麥醬發(fā)酵劑非常重要。傳統(tǒng)發(fā)酵小麥醬色澤鮮亮，口感極佳，這同參與其中的各種微生物發(fā)酵作用是緊密相關的。

醬制品的釀造過程可分為兩個主要的階段：制曲階段和高鹽發(fā)酵階段。在制曲階段起作用的主要是霉菌，其功能是產(chǎn)酶（淀粉酶、蛋白酶、酯化酶等）。由于各個地方氣候條件的差異，空氣中的微生物組成也各不相同，因此各地發(fā)酵產(chǎn)生的醬制品風味各異。醬類制品的工業(yè)化生產(chǎn)制曲所用菌種多為米曲霉，也有用黑曲霉和混合菌種制曲的。米曲霉中用得最多的是滬釀3.042[8]，也有些使用自己從自然界分離的菌種，如米曲霉Y29[9]、QU3601[10]等。本實驗以湖北荊門地區(qū)仙居小麥醬為研究對象，從小麥醬的傳統(tǒng)發(fā)酵曲中分離與小麥醬色、香、味有關的霉菌種類，篩選優(yōu)良菌種，以及研究小麥醬人工接種制曲發(fā)酵的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)自然條件下制作的小麥曲：取自湖北荊門仙居小麥醬；小麥、土豆：市售；蔗糖（分析純）、瓊脂（生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，自來水1 000 mL；自然pH；種曲培養(yǎng)基：麩皮8 g，面粉2 g，水10 g，于121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LRH-150-S電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；BYY-200B恒溫搖床：常州博遠實驗分析儀器廠；YQL-100SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TU-1901紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；JJ-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州金凈科技有限公司；90-2型恒溫磁力攪拌器：上海亞榮生化儀器廠；E-201-C型PH復合電極：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 霉菌的酶活力檢測方法

將分離得到的霉菌接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板培養(yǎng)基中，挑取單菌落重新接種至新鮮培養(yǎng)基斜面，重復3次達到活化。根據(jù)霉菌孢子濃度作適當?shù)南♂?，最后保持相同的孢子濃度接種到種曲培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)40 h后取樣檢測結果。

取5 g樣品，置于250 mL三角瓶中，加入50 mL生理鹽水，30℃、150 r/min恒溫搖床振搖30 min，用4層紗布過濾獲得酶液，供測定用。

α-淀粉酶（液化型淀粉酶）的檢測：GB 8275—2009《食品添加劑α-淀粉酶制劑》[11]；糖化型淀粉酶的檢測：GB 8276—2006《食品添加劑糖化酶制劑》[12]；蛋白酶的檢測：GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[13]。

酯化酶活力的測定[14]：取10 mL環(huán)己烷、3.65 mL乙醇、6.25 mL己酸（所有試劑每500 mL加入30 g無水硫酸鈉）及0.2 mL酶液，酯化反應在密閉的100 mL錐形瓶中進行，反應溫度為36℃，24 h后，取上清液0.5 mL于50 mL錐形瓶中，加入5 mL水，2滴酚酞，滴定至終點，測定己酸消耗量。

酶活力單位定義：在測定條件下每分鐘消耗1 μmol己酸所需要的酶量為1個酶活力單位，U。

1.3.2 黃曲霉素的測定

GB/T5009.22—2003《食品中黃曲霉毒素B1的測定》[15]。1.3.3小麥醬制曲工藝參數(shù)確定

（1）接種量：將蒸熟的小麥分別接種3%、4%、5%、6%、7%曲霉，在30℃溫度條件下發(fā)酵48 h進行試驗，根據(jù)測定曲霉蛋白酶活力確定最佳接種量。

（2）制曲溫度：將蒸熟的小麥接種3%曲霉，分別設定制醅溫度為26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，發(fā)酵48 h進行試驗，以曲霉蛋白酶活力為主要指標，確定最佳制曲溫度。

（3）制曲時間：將蒸熟的小麥接種3%曲霉，在30℃溫度條件下，分別發(fā)酵46 h、54 h、62 h、70 h、78 h進行試驗，以曲霉蛋白酶活力為主要指標，確定最佳制曲時間。

2 結果與分析

2.1 優(yōu)勢霉菌菌株的鑒定[16-17]

從小麥醬曲中挑取其中的優(yōu)勢菌株純化后轉至斜面保存以備鑒定之用。經(jīng)過對霉菌的分離純化，最后在傳統(tǒng)樣中分離得到6株菌，根據(jù)菌落形態(tài)和顯微鏡下分生孢子頭形態(tài)觀察，得到1～4號菌菌落初帶黃色，然后變成黃綠色，老后顏色變暗，反面無色。低倍顯微鏡下觀察可見分生孢子頭呈疏松放射狀，有時形成不明顯的柱狀，分生孢子頭呈黃-綠色至深橄欖-褐，分生孢子梗粗糙無色，初步判斷屬于黃曲霉群。以下分別標號黃1、黃2、黃3、黃4；5～6號菌菌絲初為白色，厚絨狀；菌落表面黑色，反面無色。分生孢子頭幼時球形，后變成放射形，初步判斷為曲霉科，屬于黑曲霉群。以下分別標號黑1、黑2。

2.2 霉菌酶活力檢測結果

2.2.1 霉菌產(chǎn)淀粉酶能力的比較

6種不同霉菌產(chǎn)液化型淀粉酶（α-淀粉酶）和糖化型淀粉酶能力如圖1所示。

由圖1可見，黑1號曲霉產(chǎn)α-淀粉酶能力最高，黑2號和黃4號曲霉產(chǎn)α-淀粉酶能力也較強。黃4號曲霉產(chǎn)糖化型淀粉酶能力最強，其他菌種均較弱。

2.2.2 霉菌產(chǎn)蛋白酶能力的比較

不同霉菌產(chǎn)中性蛋白酶能力結果如圖2所示。

由圖2可見，黃1、黃4和黑1號菌株產(chǎn)中性蛋白酶能力都較強，其中黃4號產(chǎn)蛋白酶的能力最強。

2.2.3 霉菌產(chǎn)酯化酶能力的比較

不同霉菌產(chǎn)酯化酶能力結果如圖3所示。

由圖3可見，黑1號曲霉產(chǎn)酯化酶的能力最強，其次是黃1和黃4號菌株。

綜合以上數(shù)據(jù)，黃4號曲霉其各項產(chǎn)酶能力都較高，可以作為人工單菌種發(fā)酵制小麥曲菌種。對其進行黃曲霉素檢測，結果表明其不產(chǎn)黃曲霉毒素，可以用于生產(chǎn)制曲。

2.3 制曲工藝的確定

將篩選出的黃4號曲霉作為小麥醬發(fā)酵菌種，通過研究其在不同接種量、時間和發(fā)酵溫度條件下所產(chǎn)生的蛋白酶活力變化，確定其制曲工藝參數(shù)。

2.3.1 接種量的影響

接種量對小麥曲蛋白酶酶活的影響結果如圖4所示。

由圖4可知，接種量為4%時，麥曲里蛋白酶酶活達到最大，之后隨著接種量的增加蛋白酶酶活反而減少，接種量在5%和6%時，蛋白酶活力變化平緩，可在7%的接種量時蛋白酶活力迅速減小。這可能是曲霉接種量過多不宜于菌種之間的生長，接種量太大，營養(yǎng)物質有限，不足以維持曲霉的生長所需，將形成大量的休眠孢子，降低酶的活性。曲霉接種量太少的話，繁殖量達不到要求，會造成營養(yǎng)浪費。因此，確定小麥醬制曲的最佳接種量為4%。

2.3.2 制曲溫度的影響

制曲溫度對小麥曲蛋白酶酶活的影響結果如圖5所示。

由圖5可知，適宜的溫度有利于微生物的繁殖，產(chǎn)生較高的蛋白酶酶活。隨著制曲溫度上升，小麥曲的蛋白酶活逐漸升高，在32℃時達到峰值，這與曲霉最適生長溫度在30℃左右的結果是相符合的。溫度過高過低都不利于微生物的生長。因此確定純種發(fā)酵麥醬制曲最佳溫度為32℃。

2.3.3 制曲時間的影響

制曲時間對小麥曲蛋白酶酶活的影響結果如圖6所示。

由圖6可知，接種后的小麥曲隨著制曲時間的增長，其蛋白酶活力也逐漸增高，70 h時酶活最高。制曲時間過長，微生物進入衰弱期，蛋白酶分泌量降低，同時蛋白質降解過度，反而影響了小麥醬風味。觀察曲霉孢子密度、顏色深淺、曲料香味，也可以確定最佳制曲時間為70 h。

3 結論

從自然發(fā)酵小麥醬曲中分離純化得到6種霉菌，對其進行α-淀粉酶、糖化型淀粉酶、蛋白酶和酯化酶產(chǎn)酶能力的測定，經(jīng)綜合考慮，篩選出黃曲霉4號菌株為最適于單菌種發(fā)酵制小麥醬的菌株。研究接種黃4號曲霉制備小麥醬曲工藝，確定最佳制曲工藝參數(shù)為接種量4%，制曲時間70 h，制曲溫度32℃。在此條件下制得的小麥曲蛋白酶活力達到549 U/g，而自然發(fā)酵制曲的蛋白酶活力481 U/g。由此可見，篩選出的黃4號曲霉菌株經(jīng)過優(yōu)化工藝制曲，不僅縮短了制曲時間，同時提高了小麥曲的質量，為小麥醬的進一步發(fā)酵提供有益條件。

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CHEN Qingchan,JIAN Qingmei*,WANG Jinsong,SUN Aihong,LI Rong
(College of Bioengineering,Jingchu University of Technology,Jingmen 448000,China)

FourAspergillus flavusstrains and twoAspergillus nigerstrains were isolated from natural fermented wheat paste,and the physiological value of the strains were analyzed.Results showed thatA.flavus4 had the strongest ability to produce saccharifying amylase and protease,and strong ability to produce α-amylase and ester enzyme,which was suitable for fermenting wheat paste.The optimum fermentation conditions were strain inoculum 4%,starter-making temperature 32℃and time 70 h.Under this condition,the wheat starter protease activity was 549 U/g,which was much higher than that in the natural fermented koji(481 U/g).

wheat paste;Aspergillusstrains;koji making

TS264.2

A

0254-5071（2015）04-0086-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.019

2015-04-01

荊門市級研究與開發(fā)引導計劃項目（2013YD43）

陳清嬋（1983-），女，講師，博士，研究方向為風味食品。

*通訊作者：簡清梅（1975-），女，副教授，碩士，研究食品營養(yǎng)與安全。