馬國(guó)燕 盧 靜 景 麗

河北省邯鄲市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（056001）

在臨床實(shí)踐中，對(duì)男性生育功能的評(píng)估主要依靠精液分析，然而常規(guī)精液分析只檢測(cè)精子濃度、活力及形態(tài)學(xué)等參數(shù)，僅反映精子的質(zhì)量，而只有精子的功能才能反映精子的授精能力。正常授精精子要經(jīng)歷獲能、頂體反應(yīng)、與透明帶結(jié)合及穿透等一系列過(guò)程［1］。精子功能試驗(yàn)可檢測(cè)精子執(zhí)行這些功能的情況，包括精子膜完整性、頂體反應(yīng)、精子核成熟度和DNA完整性、活性氧（ROS）、精子與透明帶相互作用、精子-宮頸黏液相互作用檢測(cè)等［2］，本文主要概述近年來(lái)常用的精子功能檢測(cè)方法及研究進(jìn)展。

1 精子膜完整性檢測(cè)

精子膜完整性與精子運(yùn)動(dòng)、獲能、頂體反應(yīng)、精卵融合等均密切相關(guān)，對(duì)男性不育的診治具有重要意義［3］。對(duì)于無(wú)精子癥的患者實(shí)施睪丸取精并行卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（ICSI）時(shí)，由于睪丸精子無(wú)運(yùn)動(dòng)能力，需在ICSI操作前鑒別其活力，因此臨床上可應(yīng)用伊紅-Y水試驗(yàn)、低滲腫脹試驗(yàn)檢驗(yàn)精子膜完整性，作為判斷精子功能的重要指標(biāo)之一［4］。精子膜主要分頭部膜和尾部膜。精子活體染色試驗(yàn)可用于評(píng)價(jià)精子頭部膜的完整性，依據(jù)核著色與否來(lái)判定精子頭部膜的完整性；精子尾部低滲腫脹試驗(yàn)已在評(píng)價(jià)精子功能方面得到廣泛應(yīng)用；伊紅-Y水試驗(yàn)不僅可通過(guò)檢測(cè)精子尾部腫脹率來(lái)反映精子膜完整性，同時(shí)也可以通過(guò)檢測(cè)精子頭部著色情況來(lái)評(píng)估精子頭部膜結(jié)構(gòu)的完整性，因而廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)中。研究發(fā)現(xiàn)精子尾部腫脹率與精子密度、活力、活率呈顯著正相關(guān)，與精液白細(xì)胞濃度呈負(fù)相關(guān)［5］，這說(shuō)明精子膜完整性可能與精液參數(shù)密切相關(guān)，因此可將其作為評(píng)價(jià)男性生育力的重要指標(biāo)之一而應(yīng)用于臨床。

2 精子頂體反應(yīng)測(cè)定

頂體反應(yīng)在精子穿過(guò)透明帶與卵細(xì)胞膜結(jié)合的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是精子的重要功能之一。無(wú)頂體或精子誘發(fā)頂體反應(yīng)缺陷／頂體反應(yīng)較弱均可導(dǎo)致受精障礙。若精子與透明帶結(jié)合前發(fā)生了自發(fā)性頂體反應(yīng)，精子就失去了授精能力，研究發(fā)現(xiàn)自發(fā)性頂體反應(yīng)率＞10%即提示精子質(zhì)量差［6］。通過(guò)體外誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率檢測(cè)可預(yù)測(cè)體外受精（IVF）結(jié)局，為臨床男性因素不孕的夫婦選擇適宜的輔助生殖技術(shù)（ART）提供幫助，因?yàn)榫撼Ｒ?guī)分析正常但頂體反應(yīng)明顯低下且反復(fù)受精失敗的患者若選擇ICSI，其受精率、植入率和妊娠率仍然很低［7-8］。目前最簡(jiǎn)便的方法是熒光標(biāo)記的豌豆凝集素法［9］，可區(qū)分頂體正?；虍惓５木?。

3 精子核成熟度和DNA完整性測(cè)定

精子DNA結(jié)構(gòu)完整性對(duì)正常受精和胚胎發(fā)育具有重要意義，測(cè)定精子核成熟度和DNA完整性可反映精子的授精能力，并作為精液常規(guī)分析的補(bǔ)充，更好地反映男性的生育能力［10］。研究表明，精子DNA完整性可直接影響ART的受精率、胚胎質(zhì)量和妊娠率。DNA損傷精子比例與胚胎質(zhì)量和ICSI后的妊娠結(jié)局呈負(fù)相關(guān)［11-12］。

目前關(guān)于精子DNA損傷對(duì)IVF和ICSI的影響還存在廣泛爭(zhēng)議［13］。精子DNA異常不僅可導(dǎo)致受精失敗，還可導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育、流產(chǎn)和胎兒畸形等。ICSI技術(shù)的發(fā)展使越來(lái)越多的嚴(yán)重少弱畸精子癥患者獲得生育希望，但由于臨床行ICSI時(shí)人為選擇形態(tài)和活力好的精子，不能確保其遺傳物質(zhì)正常，故有增加胚胎遺傳病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，因此在ICSI前需評(píng)估精子DNA。該檢測(cè)具有重要的臨床意義，不僅可深入評(píng)估男性生育力，還可指導(dǎo)治療及預(yù)測(cè)ART治療結(jié)局。

檢測(cè)精子DNA損傷的方法可分為兩大類(lèi)，一種是直接利用探針來(lái)檢測(cè)DNA斷裂的位點(diǎn)，評(píng)估DNA的損傷程度，包括末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d UTP末端標(biāo)記法（TUNEL）和原位缺口平移法（ISNT）等。另一種根據(jù)受損DNA易變性的原理，包括彗星實(shí)驗(yàn)、吖啶橙試驗(yàn)（AOT）、染色體擴(kuò)散試驗(yàn)（SCD）、精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（SCSA）［14］。上述技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，在使用過(guò)程中應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)條件適當(dāng)選擇，并且以上方法對(duì)精子均有損傷，檢測(cè)后的精子不能用于輔助生殖。近年來(lái) Mallidis等［15］利用拉曼顯微鏡，通過(guò)特異性的拉曼光譜檢測(cè)精子中亞細(xì)胞成分，受損的精子線粒體可發(fā)生明顯的改變，從而在分子水平檢測(cè)精子DNA損傷，此項(xiàng)技術(shù)可用于ART中精子的篩選。

4 精子與透明帶結(jié)合及穿透試驗(yàn)

人卵透明帶（hZP）在精卵識(shí)別與結(jié)合、誘發(fā)頂體胞吐以及阻止多重受精等方面起關(guān)鍵作用。目前已知hZP由4種糖蛋白構(gòu)成。對(duì)于hZP生物活性的研究受人卵缺乏及倫理學(xué)等影響，受到了極大限制，為此科學(xué)家們利用基因工程技術(shù)獲取了重組人透明帶糖蛋白（rhZP），現(xiàn)已將其廣泛用于精子與透明帶相互作用的研究中。rhZP3也被應(yīng)用于檢測(cè)精子功能，評(píng)估男性生育能力［16-18］。

無(wú)論精子與透明帶結(jié)合障礙還是透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)障礙，都會(huì)影響精子對(duì)透明帶的穿透作用，也有些精子能夠結(jié)合到卵子透明帶上，且發(fā)生頂體反應(yīng)，卻不一定穿透透明帶而受精，因此精卵穿透試驗(yàn)?zāi)軌蚋玫仡A(yù)測(cè)精子的授精能力。因?yàn)檫@類(lèi)患者行IVF治療受精率會(huì)下降，甚至受精完全失敗。對(duì)于規(guī)模較大的生殖中心，如果不明原因不孕患者行IVF失敗且卵子較多，可以在其進(jìn)入治療周期前利用廢棄卵子進(jìn)行精卵結(jié)合及透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)試驗(yàn)，從而判斷精子的授精能力，檢測(cè)出精子功能缺陷的患者［19］，但尚存在倫理問(wèn)題，而且盡管這些試驗(yàn)對(duì)評(píng)估精子的授精能力、IVF及ICSI的選擇及妊娠結(jié)局預(yù)測(cè)均有積極的作用，但因?yàn)椴僮鞅容^繁瑣，不適于臨床普及應(yīng)用。

5 ROS測(cè)定

ROS在男性不育癥診治中的作用越來(lái)越受重視，因?yàn)镽OS是DNA損傷的一個(gè)重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，ROS與男性不育具有一定相關(guān)性，適量ROS在維持男性生殖功能，如激素的產(chǎn)生、精子獲能、頂體反應(yīng)以及精子活力等方面發(fā)揮重要作用［20］。精漿中的抗氧化物使ROS的產(chǎn)生和清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)這種平衡遭到破壞，過(guò)量即會(huì)導(dǎo)致精子膜、精子線粒體、精子核DNA完整性的損傷，影響精子存活和運(yùn)動(dòng)能力，引發(fā)男性不育。Zalata等［21］研究顯示，精液ROS含量與精子活率、正常形態(tài)率均呈顯著負(fù)相關(guān)，與精子密度及不成熟精子率呈正相關(guān)。但 Hammadeh等［22］研究認(rèn)為精漿中ROS濃度會(huì)影響精子質(zhì)量，對(duì)精子授精能力有一定影響，而與卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及IVF／ICSI周期妊娠率均無(wú)相關(guān)性。精液的優(yōu)化處理可使精子的應(yīng)激狀態(tài)得到緩解，改善精子的微環(huán)境，從而為抗氧化藥物治療男性不育癥、改善IVF的妊娠結(jié)局提供了理論依據(jù)［23］。

6 精子-宮頸黏液相互作用試驗(yàn)

該試驗(yàn)主要用于評(píng)估精子能否穿透宮頸黏液，可觀察精子穿透密度、遷移距離、遷移密度減少程度及觀察精子在宮頸黏液中一定時(shí)間的存活情況，因此是診治不育癥的一項(xiàng)重要指標(biāo)。在體外試驗(yàn)中應(yīng)用人宮頸黏液有很多缺點(diǎn)，宮頸炎癥和p H值等因素影響宮頸黏液質(zhì)量，從而影響對(duì)精子穿透力的判斷，故在臨床檢測(cè)中不斷探索尋找一種與人宮頸黏液的物理特性相近，能夠完全接受人類(lèi)精子的宮頸黏液替代物。近期有研究證明，蛋清完全可以代替宮頸黏液用于臨床精子穿透力檢測(cè)［24］。操作簡(jiǎn)單，且能有效避免影響宮頸黏液質(zhì)量的因素。

7 小結(jié)及展望

ICSI目前已成為男性不育治療不可忽視的方法，雖然ICSI克服了精子數(shù)量不足或直接從附睪、睪丸獲取精子治療不育，但是這種受精方式違背了自然受精的生物學(xué)法則，具有很大的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，有可能將染色體畸變、缺失或基因突變等遺傳缺陷及表觀遺傳缺陷傳給下一代或誘發(fā)相關(guān)的疾?。?5］。表觀遺傳學(xué)是近年來(lái)在國(guó)際上迅猛發(fā)展的研究領(lǐng)域，通過(guò)DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾等不改變核苷酸序列的方式將遺傳信息傳遞給子代［26］。ART治療時(shí)有待于建立精子DNA甲基化和組蛋白乙?；缺碛^遺傳學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，從表觀遺傳因子水平對(duì)不同形態(tài)的精子進(jìn)行評(píng)價(jià)，切實(shí)控制ART精子的質(zhì)量，降低精子表觀遺傳缺陷風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，目前尚未確定出一種簡(jiǎn)單、精確的精子功能檢測(cè)方法，要正確評(píng)估男性的生育能力，應(yīng)結(jié)合臨床實(shí)際對(duì)精子的各項(xiàng)功能進(jìn)行綜合測(cè)定，并且篩選必要的檢查項(xiàng)目應(yīng)用于輔助生殖的治療過(guò)程中。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善及對(duì)男性不育癥的深入研究，有望研究出便于臨床應(yīng)用的價(jià)廉且簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)方法，從而更好地解決男性的不育問(wèn)題。

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