趙　冉，楊　羊，徐　晨，李二敏，陸　超，孫　寧，錢睿哲(復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海200433)

生物鐘基因Clock對iPSCs分化作用的研究

趙冉，楊羊，徐晨，李二敏，陸超，孫寧，錢睿哲△
(復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海200433)

目的:研究生物鐘基因Clock對干細(xì)胞分化成熟過程的影響和機制。方法:我們將攜帶有Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4的TetO-FUW-OSKM慢病毒轉(zhuǎn)染入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中，利用PCR、免疫熒光法、堿性磷酸酶染色和擬胚體形成實驗鑒定細(xì)胞的多能性。通過RNAi技術(shù)抑制Clock基因表達(dá)，觀察Clock基因?qū)PSCs分化的影響。結(jié)果:小鼠MEF在轉(zhuǎn)染后12 d形成典型的小鼠ESC樣克隆。RT-PCR顯示iPSCs表達(dá)多能性基因Nanog、Sox2、Oct4、Dax1、Esg1、ERas、Zfp296和Klf4;細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽性;細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示有Oct4和SSEA1的表達(dá);培養(yǎng)可見擬胚體的形成。因此，我們成功將小鼠MEF重編程為iPSCs。細(xì)胞非定向分化實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染48 h后，對照組克隆邊緣不光滑，有偽足伸出，提示iPSCs存在分化; Clock-siRNA組的iPSCs克隆仍保持邊緣光滑，極少有偽足伸出，RT-PCR提示多能性基因Sox2、Oct4和Klf4表達(dá)較對照組升高。結(jié)論:生物鐘基因Clock可能參與了iPSCs的分化過程。

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