康桂英

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼 028000）

雞球蟲(chóng)病的免疫預(yù)防研究進(jìn)展

康桂英

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼 028000）

雞球蟲(chóng)病是由一種或多種球蟲(chóng)引起，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害比較嚴(yán)重的腸道寄生蟲(chóng)病。該病多發(fā)于15～50日齡的雛雞，發(fā)病率與死亡率都極高。成年雞多為帶蟲(chóng)者，對(duì)其生產(chǎn)能力有一定的影響。據(jù)報(bào)道，英國(guó)每年由于雞球蟲(chóng)病造成的損失約為4 200萬(wàn)英鎊；美國(guó)每年由于雞球蟲(chóng)病造成的直接或間接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)20～30億美元。目前，該病已被美國(guó)列為對(duì)禽類(lèi)危害最嚴(yán)重的五大傳染病之一。隨著球蟲(chóng)病的藥物防治成本不斷提高、藥物殘留問(wèn)題和耐藥蟲(chóng)株的出現(xiàn)，研究者們將防治雞球蟲(chóng)病的重點(diǎn)由藥物防治逐漸轉(zhuǎn)移到免疫預(yù)防，用疫苗免疫球蟲(chóng)病將成為球蟲(chóng)病防治的發(fā)展趨勢(shì)，人們所用的疫苗有強(qiáng)毒苗，弱毒苗、基因工程苗和單克隆抗體。

1 強(qiáng)毒苗

強(qiáng)毒苗就是指利用自然界分離的強(qiáng)毒蟲(chóng)株制備的疫苗。常用的制備方法是收集自然發(fā)生雞球蟲(chóng)病的病雞糞便中的混合卵囊，然后，再用單卵囊分離法把不同種類(lèi)的艾美耳球蟲(chóng)分離出來(lái)并增殖，加入適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，然后再按一定的比例混合制成強(qiáng)毒活苗?；蛟谑占涯乙院螅环蛛x卵囊，而是使用混合卵囊來(lái)制備強(qiáng)毒蟲(chóng)苗。目前，世界上的雞球蟲(chóng)強(qiáng)毒疫苗有美國(guó)生產(chǎn)的“Coccivac”，加拿大的“Immucox”。我國(guó)也有一些教學(xué)和科研單位研究出強(qiáng)毒疫苗，其效果與進(jìn)口疫苗相仿。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲(chóng)研究組曾用由5種雞艾美耳球蟲(chóng)和懸浮劑制成的疫苗對(duì)肉仔雞進(jìn)行免疫接種，結(jié)果顯示接種后雞無(wú)不良反應(yīng)，接種6周后能抵抗20萬(wàn)混合孢子化卵囊的攻擊。陳明勇[1]用幼嫩艾美耳球蟲(chóng)強(qiáng)毒苗長(zhǎng)期低水平的免疫雞后，雞體能產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)。

雞在低劑量感染強(qiáng)毒苗時(shí)不會(huì)出現(xiàn)病理現(xiàn)象，但是，卵囊會(huì)留在雞體內(nèi)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，并且伴有新的卵囊排出體外，排出體外的卵囊混合在雞的生活環(huán)境中，雞再接觸時(shí)又一次感染，通過(guò)這樣的幾次感染免疫后，雞就能夠得到較好的免疫保護(hù)。盡管強(qiáng)毒苗能誘使雞發(fā)生免疫應(yīng)答從而產(chǎn)生免疫保護(hù)，但由于強(qiáng)毒苗的毒性較強(qiáng)，所以，容易引發(fā)雞群發(fā)生雞球蟲(chóng)病。其次，由于接種疫苗，有可能給沒(méi)有球蟲(chóng)病的雞群帶來(lái)強(qiáng)毒的球蟲(chóng)，引發(fā)球蟲(chóng)病。由于以上這些缺點(diǎn)，人們又開(kāi)始把研究目標(biāo)放在了弱毒苗上。

2 弱毒苗

制備弱毒苗采用毒性致弱的卵囊。自然界能分離到弱毒蟲(chóng)株的情況尚未見(jiàn)到報(bào)道，一般都是通過(guò)人工方法使毒株的毒力減弱，使其對(duì)宿主的危害降低，但是，能使宿主產(chǎn)生足夠的免疫力從而達(dá)到免疫的效果。目前，人工制備弱毒苗的方法有：雞胚傳代致弱、早熟選育、理化處理及細(xì)胞培養(yǎng)等。

2.1 雞胚傳代致弱

用雞胚培養(yǎng)球蟲(chóng)子孢子，球蟲(chóng)子孢子在雞胚尿囊膜上連續(xù)生長(zhǎng)幾代后，其致病力下降，但其免疫原性不變，用這樣的球蟲(chóng)制備疫苗稱之為雞胚傳代致弱蟲(chóng)苗。Long等[2]首次用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)培養(yǎng)出雞胚致弱蟲(chóng)株，其致病力低于親本株，同時(shí)也能使宿主產(chǎn)生免疫，抵抗強(qiáng)毒的攻擊。雞胚傳代致弱疫苗的免疫力也相對(duì)較穩(wěn)定，例如，樊生超等[3]將柔嫩艾美耳球蟲(chóng)雞胚適應(yīng)株連續(xù)回雞6代仍然沒(méi)有返祖現(xiàn)象，致病性依舊較低，沒(méi)有威脅。樊玉娟[4]在對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，致弱后的卵囊在致病力、繁殖能力較原始株有所減弱，免疫原性保持良好。但球蟲(chóng)的免疫原性會(huì)受傳代次數(shù)的影響，傳代次數(shù)增多，球蟲(chóng)的免疫原性會(huì)減弱甚至消失，而且雞胚適應(yīng)株回歸雞連續(xù)傳代一定次數(shù)后，有可能出現(xiàn)致病性恢復(fù)的現(xiàn)象。此外，巨型艾美耳球蟲(chóng)、堆型艾美耳球蟲(chóng)和早熟艾美耳球蟲(chóng)不能使用雞胚傳代方法致弱。

2.2 早熟選育

早熟選育篩選蟲(chóng)苗的過(guò)程是將自然界分離的蟲(chóng)株通過(guò)雞體連續(xù)傳代，篩選出早熟蟲(chóng)株。致弱蟲(chóng)株與親代相比，生活史周期大大縮短，產(chǎn)出的卵囊量也減少了，致病力降低，但是免疫原性仍然保持良好。McDonald等[5]研制的巨型艾美耳球蟲(chóng)早熟系，潛伏期從120 h減少到107 h，致病能力和繁殖能力都比親本代有所降低；史宗勇等[6]對(duì)毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株的致病性和繁殖力進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示裂殖階段裂殖次數(shù)減少，時(shí)間縮短，裂殖子數(shù)量減少，從而導(dǎo)致繁殖能力下降，繼而致病力降低。段家樹(shù)等[7]采用早熟選育的方法，成功研制了單價(jià)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)弱毒。國(guó)內(nèi)外研究者應(yīng)用這種選育方法已經(jīng)成功研制出了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)，堆型艾美耳球蟲(chóng)和巨型艾美耳球蟲(chóng)的早熟苗，其致病力低，免疫原性和親代相仿。研究者們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)所有球蟲(chóng)都可以通過(guò)這種方法來(lái)致弱。

2.3 理化處理

就是通過(guò)物理和化學(xué)方法對(duì)球蟲(chóng)卵囊進(jìn)行處理，使其致病力降低。常用的方法有冷凍、加熱、輻射，化學(xué)誘變劑等。吳兆敏等[8]證明了用化學(xué)誘導(dǎo)劑NTG處理后的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)免疫小雞后，雛雞可以獲得保護(hù)性免疫，球蟲(chóng)毒力下降的同時(shí)其繁殖能力也有所下降。很多人懷疑輻射致弱并不是真的致弱，而是減少了活卵囊的數(shù)量。Jenkins等[9]經(jīng)過(guò)免疫組化研究證明，卵囊被輻射減毒致弱后，卵囊的裂殖階段停止，沒(méi)有繼續(xù)發(fā)育。這個(gè)研究結(jié)果否定了人們對(duì)輻射致弱的本質(zhì)的懷疑。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)

Zhang等[10]將柔嫩艾美耳球蟲(chóng)用雞腎細(xì)胞培養(yǎng)，球蟲(chóng)經(jīng)過(guò)雞腎細(xì)胞與雞體交替?zhèn)鞔?4代以后，將原代球蟲(chóng)F0和第14代球蟲(chóng)F14分別免疫試驗(yàn)雞，結(jié)果顯示，兩種球蟲(chóng)都能使雞體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，F(xiàn)14的致病性和死亡率都有所降低。其主要原因是由于F1～F14與F0代相比出現(xiàn)了一些質(zhì)的變化，這個(gè)變化是多個(gè)卵囊可以同時(shí)寄生在一個(gè)原代雞腎細(xì)胞內(nèi)。在多重感染的細(xì)胞周?chē)?，人們還發(fā)現(xiàn)了一些正常的細(xì)胞，這表明不同的宿主細(xì)胞對(duì)裂殖子的易感性不同。

3 基因工程苗

致弱蟲(chóng)株制備出的活苗多次接種回歸雞體后會(huì)不會(huì)出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，這是一個(gè)令人擔(dān)憂的問(wèn)題，所以研究者開(kāi)始關(guān)注基因工程疫苗。

3.1 重組蛋白疫苗

將雞球蟲(chóng)的抗原基因與表達(dá)載體重組，將重組子轉(zhuǎn)入細(xì)菌或細(xì)胞中進(jìn)行高效表達(dá)，收集并純化表達(dá)的球蟲(chóng)抗原蛋白，利用這些蛋白制備的疫苗即重組蛋白疫苗。徐占云等[11]截取了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的一部分抗原基因λMzp5-7，使其與載體重組后將其在大腸桿菌中表達(dá)形成重組抗原。將重組抗原免疫雛雞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示柔嫩艾美耳球蟲(chóng)λMzp5-7的重組抗原能使雛雞產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。彭昊等[12]在對(duì)巨型艾美耳球蟲(chóng)重組蛋白Gam82-Y的免疫原性研究實(shí)驗(yàn)中指出，Gam82-Y重組抗原能減少卵囊的排除，具有一定的免疫作用。李安興等[13]成功克隆出柔嫩艾美耳球蟲(chóng)北京株重要抗原SO7基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，用該重組抗原免疫雞后，雞能得到部分保護(hù)力。潘曉婷等[14]用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)BJ株的EtMIC和ta4兩種基因的表達(dá)產(chǎn)物免疫雞后，用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)攻擊免疫后的雞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫雞對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)具有一定的免疫力。

3.2 核酸疫苗

核酸疫苗也稱基因疫苗，就是將雞球蟲(chóng)保護(hù)性抗原基因克隆到質(zhì)粒載體中，然后導(dǎo)入宿主體內(nèi)，利用宿主的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗原蛋白，宿主細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)該蛋白的免疫應(yīng)答。例如Song K D等[15]將柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的3-1EcDNA基因克隆到質(zhì)粒pBK-CMV中，形成一個(gè)表達(dá)性的質(zhì)粒載體Pmp-13，對(duì)一日齡的雞進(jìn)行皮下注射或者肌肉注射免疫，攻毒后卵囊產(chǎn)出減少，結(jié)果表明能產(chǎn)生一定的免疫力。李文超等[16]使用其構(gòu)建的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制劑基因核酸疫苗對(duì)雛雞進(jìn)行了免疫，通過(guò)結(jié)果顯示該核酸疫苗對(duì)雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染具有一定的保護(hù)作用。大量實(shí)驗(yàn)證明，核酸疫苗能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生劇烈的CTL反應(yīng)，而雞球蟲(chóng)免疫主要以細(xì)胞免疫為主，所以核酸疫苗在球蟲(chóng)免疫方面有很大的優(yōu)勢(shì)。吳紹強(qiáng)[17]使用MTT法進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)PCT核酸疫苗的細(xì)胞免疫水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核酸疫苗PCT能很好地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)。

3.3 活載體疫苗

在雞的保護(hù)性免疫中，免疫細(xì)胞，尤其是T淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞起著重要的作用，所以，常采用合適的載體研制活載體疫苗，這樣可以模擬抗原在雞體內(nèi)的遞增過(guò)程，從而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，同時(shí)提高疫苗的保護(hù)能力。已用做雞球蟲(chóng)活載體疫苗的載體有禽痘病毒、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和火雞皰疹病毒等。杜愛(ài)芳等[18]使用減毒沙門(mén)氏菌為載體傳遞雞球蟲(chóng)DNA疫苗的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了攜帶柔嫩艾美耳球蟲(chóng)5401基因的重組菌能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，也能顯著增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖水平。用鼠傷寒沙門(mén)氏菌重組的抗原，經(jīng)口免疫能延長(zhǎng)抗原在雞體內(nèi)腸道中的作用時(shí)間；用禽痘病毒和火雞皰疹病毒重組的抗原，能誘導(dǎo)部分細(xì)胞和體液的免疫反應(yīng)。

4 單克隆抗體

自單克隆抗體被成功的制備出來(lái)，這項(xiàng)技術(shù)就發(fā)揮了重要的作用，成為疾病診斷、治療、預(yù)防領(lǐng)域中不可或缺的一項(xiàng)技術(shù)。國(guó)內(nèi)已建立起培育針對(duì)堆型艾美耳球蟲(chóng)的單克隆細(xì)胞株。在國(guó)內(nèi)，王承民等[19]利用雜交瘤技術(shù)，將堆型艾美耳球蟲(chóng)的子孢子可溶性抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，再通過(guò)間接ELISA方法篩選，得到能產(chǎn)生能對(duì)堆型艾美耳球蟲(chóng)子孢子特異性抗體的細(xì)胞株5B4和5G7。單克隆技術(shù)效果很明顯，但是還存在很多問(wèn)題。雖然單克隆抗體的特異性很強(qiáng)，但是它在體內(nèi)代謝迅速，數(shù)量過(guò)少則不能發(fā)揮其免疫特異性，有時(shí)部分抗體在體內(nèi)不能完全發(fā)揮其凝集活性。此外，制備單克隆抗體的技術(shù)很煩瑣又費(fèi)時(shí)間，篩選的抗體只能保持天然抗體的活性，有些優(yōu)良抗體基因很容易在傳代中丟失。在制備單克隆抗體時(shí)我們要結(jié)合基因工程，來(lái)彌補(bǔ)在雜交瘤細(xì)胞技術(shù)和本質(zhì)上的不足，使單克隆抗體技術(shù)更加完善。

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康桂英（1976-），女，內(nèi)蒙古涼城人，碩士，主要從事寄生蟲(chóng)及寄生蟲(chóng)病的研究。

項(xiàng)目來(lái)源：內(nèi)蒙古民族大學(xué)科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：NMD1215）