蔡汝健，蔣智勇，勾紅潮，楚品品，李 艷，宋 帥，徐志宏，李春玲

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站，廣東 廣州 510640）

【研究意義】豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種高度傳染性疾病，臨床上以母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)，產(chǎn)木乃伊胎、死胎、弱仔等繁殖障礙，及各種年齡豬呼吸困難和仔豬高死亡率為特征[1-6]。自20 世紀90年代以來，PRRS給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重阻礙了世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。因此，研究疫苗免疫效果對PRRS的防控具有重要意義。

【前人研究進展】1996年我國報道了首例PRRSV。PRRSV不斷演變，目前流行的PRRSV存在多樣性和廣泛重組現(xiàn)象，不同地方（區(qū)域）的流行毒株也存在多樣性，使得現(xiàn)有疫苗的保護力不足，增加了該病的防控難度[7-9]。疫苗免疫是傳染病防控的有效手段之一，PRRS疫苗分為滅活苗（KV）和弱毒苗（MLV）兩類。PRRSV-MLV疫苗能夠誘導(dǎo)保護性免疫反應(yīng)[10-14]，但在安全性和對異源毒株交叉保護方面令人擔憂[15-16]；PRRS-KV疫苗具有安全、不存在散布病毒和造成PRRS新疫源的危險、便于貯存和運輸、對母源抗體的干擾作用不敏感等優(yōu)點，但保護效果不確切[17-19]。養(yǎng)殖場疫苗選擇多樣，免疫程序也存在較大差異，導(dǎo)致免疫效果不佳，為PRRS防控工作帶來更大的風(fēng)險與挑戰(zhàn)。

【本研究切入點】本研究在田間條件下采用4種PRRSV疫苗組合免疫仔豬，通過免疫日齡和不同疫苗類別的免疫方案，統(tǒng)計和分析PRRSV疫苗免疫效果，以期為養(yǎng)殖場提供和制定合理的免疫程序?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過免疫后的抗體反應(yīng)、病毒血癥和生產(chǎn)參數(shù)評估PRRS疫苗免疫效果，篩選出PRRS疫苗最佳免疫方案，為PRRS防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗豬場概況 A、B、C 3個試驗豬場，規(guī)模分別為760、868、835頭基礎(chǔ)母豬。3個養(yǎng)殖場保育仔豬在30～50日齡時表現(xiàn)喘氣、呼吸困難、體溫升高、咳嗽、消瘦、毛松，保育仔豬發(fā)病率分別為100%、20%和30%。采集部分發(fā)病仔豬肺、淋巴結(jié)，RT-PCR方法檢測PRRSV核酸為陽性。3個豬場的疫苗免疫和發(fā)病情況見表1。

1.1.2 試驗動物 選取 A、B、C 3個PRRSV陽性場，每個場200頭仔豬，14日齡首免前采血檢測，PRRSV核酸均為陰性。

表1 試驗豬場保育仔豬疫苗免疫和發(fā)病情況Table 1 Vaccine immunization and morbidity in piglets

1.1.3 試驗疫苗 A、B、C 3個豬場分別采用CH-1R株、TJM-92株、VR-2332株不同PRRSV弱毒疫苗和HP-PRRSV滅活疫苗（NVDC-JXA1株），供試PRRSV疫苗均購自廣州市生牧生物科技有限公司，疫苗信息如表2所示。

表2 供試PRRSV疫苗信息Table 2 Information of PRRSV vaccines for trials

1.1.4 主要試劑 Rapure Viral RNA/DNA Kits 購自廣州美基生物科技有限公司；一步法RT-PCR試劑盒、DL2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自廣州英偉創(chuàng)津有限公司；滅菌24孔細胞培養(yǎng)板購自廣州市華粵行儀器有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測試劑盒（HerdChekPRRSX3, IDEXX Laboratories Inc., West brook, ME, USA）購自美國愛德士生物科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬群分組及免疫 3個PRRSV陽性場，每個養(yǎng)殖場200頭仔豬，隨機分成4組，每組50頭。按照免疫方案，第1組于14日齡同時免疫弱毒苗MLV+滅活KV（包括A1、B1、C1）；第2組于14日齡免疫MLV+35日齡免疫KV（包括A2、B2、C2）；第3組于14日齡、35日齡免疫MLV（包括A3、B3、C3）；第4組于14日齡免疫MLV（包括A4、B4、C4）。試驗動物分組及疫苗免疫方案如表3所示。

表3 試驗動物分組及疫苗免疫方案Table 3 Immune program and experimental animal groups

1.2.2 抗體檢測 免疫前0 d（14日齡）、二免后30 d（65日齡）對仔豬經(jīng)前腔靜脈采血，編號，3 000 r/min離心10 min分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。按照PRRSV抗體ELISA試劑盒的操作說明書對待檢血清進行檢測。

1.2.3 血清中PRRSV核酸檢測 利用RT-PCR檢測方法對血清中PRRSV核酸進行檢測。根據(jù)Rapure Viral RNA/DNA Kits試劑盒說明提取核酸。一步法RT-PCR反應(yīng)體系（50 μL）：PrimeScript 1step Enzyme Mix 4 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，模板4 μL，Buffer 25 μL，無RNA酶H2O 15 μL 。反應(yīng)程序：50℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30 min；72℃ 1 min；94℃預(yù)變性 2 min、94℃ 50 s、54℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL RT-PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/ mL溴化乙錠）電脈，最后用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

1.2.4 生產(chǎn)參數(shù)統(tǒng)計分析 統(tǒng)計試驗過程中患有呼吸疾病仔豬頭數(shù)、仔豬發(fā)病率和仔豬死淘率3個生產(chǎn)參數(shù)，對比分析各組合免疫效果。利用Graph Pad Prism 5軟件中的Unpaired Student’s t-test方法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫PRRS疫苗前后抗體檢測結(jié)果

從表4可以看出，免疫前0 d（14日齡）抗體視為母源抗體。A、B、C養(yǎng)殖場免疫前0 d（14日齡）的平均抗體水平S/P值分別為1.4、0.995和1.32。二免后30 d（65日齡）仔豬抗體檢測結(jié)果顯示，A養(yǎng)殖場A2組抗體最高，S/P值達到2.5，但與A1、A3、A4抗體水平無顯著差異；B養(yǎng)殖場：B3組抗體最高，S/P值達到2.63，但與B1、B2、B4抗體水平無顯著差異；C養(yǎng)殖場C3組抗體最高，S/P值達到2.99，但與C1、C2、C4抗體水平無顯著差異。

表4 免疫PRRS疫苗前后抗體變化Table 4 Antibody changes before and after immunization with PRRS vaccine

2.2 不同疫苗組合試驗豬血清PRRSV核酸檢測結(jié)果

豬血清中PRRSV核酸檢測結(jié)果（表5）顯示，A1～A4 組PRRSV核酸陽性率分別為16%（8/49）、12.5%（6/48）、18%（8/44）和33%（15/45）；B1～B4組PRRSV核酸陽性率分別為10.6%（5/47）、0（0/48）、0（0/45）和13.6%（6/44）；C1～C4組PRRSV核酸陽性率分別為6.3%（3/47）、8.5%（4/47）、10.8%（5/46）和18.1%（8/44）。

比較分析3個養(yǎng)殖場PRRSV核酸檢測結(jié)果，第4組PRRSV核酸陽性率（A4=33%、B4=13.6%、C4=18.1%）與第1組PRRSV核酸陽性率（A1=16%、B1=10.6%、C1=6.3%）無顯著差異，與第2組PRRSV核酸陽性率（A2=12.5、B2=0、C2=10.6%）有顯著差異，與第3組PRRSV核酸陽性率（A3=18%、B3=0、C3=10.8%）也有顯著差異。第1、2、3組PRRSV核酸陽性率兩兩分析無顯著差異。

表5 不同疫苗組合試驗豬血清PRRSV核酸檢測結(jié)果Table 5 Detection results of PRRSV nucleic acid in pig serum in different vaccination groups

2.3 不同疫苗組合試驗豬生產(chǎn)參數(shù)比較

3個豬場4個不同免疫組合患呼吸道疾病仔豬頭數(shù)分別為11、15、26、65頭，發(fā)病率分別為7.3%、10%、17.3%和43.3%，仔豬死淘率分別為4.67%、4.67%、8.67%和11.33%。

3 討論

目前我國市場上PRRS商品化疫苗在一定程度上對控制PRRS的傳播和蔓延作出了貢獻[20-23]。但由于PRRSV的生物性、抗原性和基因遺傳多樣性[24-27]，使得不同毒株之間抗原的交叉保護有限，因此來源于某一分離毒株制備的疫苗不可能有效地保護豬群對抗具有抗原差異的PRRSV所有野毒株的感染[28-30]。因此，生產(chǎn)上常見免疫疫苗的豬群發(fā)生非典型和急性PRRS 病例。因此，開發(fā)安全有效的PRRS疫苗以及制定合理的免疫方案迫在眉睫[31-35]。

本研究為了探討PRRS疫苗在PRRSV陽性場的免疫效果，選取3個PRRSV陽性場，采用不同疫苗毒株、不同疫苗組合（同時接種PRRS弱毒苗+滅活苗、先接種弱毒苗后接種滅活苗、先后接種兩次弱毒苗、接種一次弱毒苗 4個組合）的免疫方案，通過對免疫后抗體水平變化、病毒血癥和生產(chǎn)參數(shù)等方面評估疫苗免疫效果。

在當前PRRSV感染狀態(tài)下，與單一疫苗免疫組合（14日齡免疫弱毒苗）相比，兩針免疫組合（14日齡同時免疫PRRS弱毒苗和滅活苗、14日齡免疫PRRS弱毒苗和35日齡免疫滅活苗、14日齡免疫PRRS弱毒苗和35日齡免疫弱毒苗）能夠產(chǎn)生更高的抗體反應(yīng)。在病毒血癥方面，與單一疫苗免疫組合（14日齡免疫弱毒苗）相比，兩針免疫組合（14日齡免疫PRRS弱毒苗和35日齡免疫滅活苗、14日齡免疫PRRS弱毒苗和35日齡免疫弱毒苗）PRRSV核酸陽性率顯著降低。在生產(chǎn)參數(shù)方面，與單一疫苗免疫組合（14日齡免疫弱毒苗）相比，兩針免疫組合（14日齡同時免疫PRRS弱毒苗和滅活苗、14日齡免疫PRRS弱毒苗和35日齡免疫滅活苗、14日齡免疫PRRS弱毒苗和35日齡免疫弱毒苗）仔豬發(fā)病率、仔豬死淘率、呼吸道疾病的仔豬頭數(shù)明顯降低。

4 結(jié)論

本研究在3個PRRSV陽性豬場采用4種不同PRRS疫苗組合，通過對免疫后抗體水平變化規(guī)律、病毒血癥和生產(chǎn)參數(shù)等方面評估疫苗免疫效果，結(jié)果表明， 14日齡同時免疫PRRS弱毒苗和滅活苗、14日齡免疫PRRS弱毒苗和35日齡免疫滅活苗兩種免疫組合的免疫效果最好。這兩種免疫組合可以為PRRSV陽性豬場的PRRS防控提供參考。