王 瑞，林毓娥，杜 虎，金慶敏，楊曉珊，吳廷全

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】瓜類疫病是由瓜類疫霉（Phytophthora melonisKatsura）引起的毀滅性病害[1]，可以侵染黃瓜、冬瓜、節(jié)瓜、南瓜等瓜類作物[2]。瓜類疫病在全國各地均有發(fā)生，特別是華南地區(qū)春、夏季節(jié)雨水多、濕度大，易引起疫病的爆發(fā)和傳播。該病一旦發(fā)生，化學藥劑難以控制，損失嚴重，一般年份減產(chǎn)30%，病害流行年份則幾乎絕收，對瓜類生產(chǎn)和育種構成嚴重威脅。目前尚未有有效化學手段防治該病害，發(fā)掘瓜類抗性基因資源、培育抗性品種是控制這一病害最有效的策略，因此建立快速鑒定瓜類疫病抗性方法尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】早在1981年翁祖信等[3]就提出菌絲塊活體接種黃瓜幼苗的方法，1983年又提出用孢子懸浮液接種活體黃瓜幼苗，均可引起植株發(fā)病。賴莉玉等[4]采用涂抹濃度為102個孢子/mL的菌液法對135份山東黃瓜品種資源進行抗疫病鑒定，篩選到21份抗性品種材料。王平勇等[5]利用1×106/mL的孢子懸浮液灌根接種166份甜瓜材料，篩選到14份抗疫病甜瓜材料。柴喜榮等[6]利用5×103個孢子/mL濃度的孢子懸浮液灌根接種黃瓜材料，沒有篩選到抗性材料，并對其接種后防御相關酶進行研究。周克琴、劉學敏等均對南瓜疫病抗性苗期接種方法進行了研究[7-8]。以上方法能夠篩選到一定的抗病材料，但無論是活體接種[9]、灌根、噴霧還是注射接種，都容易將病原菌帶到田間引起集中爆發(fā)，不利于疫病的防治工作；同時，疫病致死率高，不容易保存中間材料及感病材料，極大影響了抗性基因的相關研究工作[10]。此外，常規(guī)鑒定方法對發(fā)病條件要求苛刻，需要提供穩(wěn)定的溫度和濕度，一般光照培養(yǎng)箱難以滿足大量材料的鑒定。【本研究切入點】基于以上問題，本研究以黃瓜為例，擬建立一個快速、精準、高通量、安全有效的疫病抗性鑒定技術體系。選擇兩個抗感差異明顯的黃瓜材料為研究對象，探討葉片離體接種方法的條件，并通過與灌根法、噴霧法、浸泡法進行比較，最終建立室內(nèi)離體快速鑒定瓜類疫病的技術體系；同時利用離體葉片接種法對40份黃瓜資源進行疫病抗病性鑒定，以期為瓜類的抗病育種奠定基礎?！緮M解決的關鍵問題】建立離體接種快速鑒定瓜類疫病技術體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃瓜抗性材料JSH和感病材料B80，以及用于抗性篩選40份黃瓜種質(zhì)資源材料，均由廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所林毓娥研究員提供。試驗于2018年12月20日至2019年1月15日在廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所實驗室進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備 將10% V8培養(yǎng)液倒入滅菌培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，每皿15～20 mL。將新鮮培養(yǎng)的疫霉菌菌絲塊（大小約2 mm×2 mm）8～10塊移入培養(yǎng)液中，在25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)2～3 d。待菌絲叢形成后，傾去培養(yǎng)液，用15～20 mL滅菌水沖洗懸浮菌絲叢2次，置于25 ℃、黑暗中培養(yǎng)，直至孢子大量產(chǎn)生[11]。用紗布過濾菌絲，用血球計數(shù)板測定孢子濃度，并稀釋到所需濃度。

1.2.2 接種方法 （1）灌根法：黃瓜待測材料及抗、感對照材料播種于10 cm×10 cm盆缽中，置于光照培養(yǎng)箱（白天28 ℃、晚上26 ℃，濕度均為85%）中培養(yǎng)20 d，瓜類疫霉菌孢子懸浮液調(diào)整至102、103、104個孢子/mL，每個盆缽灌根30 mL，置于光照培養(yǎng)箱中溫度28 ℃、濕度90%、黑暗培養(yǎng)24 h，之后在白天30 ℃、晚上28 ℃、濕度90%條件下繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后調(diào)查發(fā)病情況。

（2）噴霧法：將培養(yǎng)20 d的黃瓜材料置于密閉容器內(nèi)，分別噴霧102、103、104孢子懸浮液，每個濃度處理3次重復，每個重復3 d后觀察發(fā)病情況。

（3）浸根法：將培養(yǎng)20 d的黃瓜植株根部土壤洗凈，分別浸泡在102、103、104孢子懸浮液中，置于光照培養(yǎng)箱（白天28 ℃、晚上26 ℃，濕度均為90%）中，每個濃度處理3次重復，每個重復10株，24 h后觀察發(fā)病情況。

（4）菌塊離體接種法：利用V8、PDA或皮氏培養(yǎng)基（固體）在28 ℃條件下黑暗培養(yǎng)瓜類疫霉菌3～4 d，將黃瓜待測材料及抗、感對照材料播種于盆缽中，置于光照培養(yǎng)箱（白天28 ℃、晚上26 ℃，濕度均為85%）中培養(yǎng)7 d。用打孔器或改造后的移液器槍頭切取菌圈周圍最新鮮的微菌塊（直徑約2 mm），取黃瓜子葉，將其背面向上置于培養(yǎng)皿中的濕潤濾紙上，將微菌塊菌絲向下放置于黃瓜子葉上；將接種疫霉菌后的黃瓜子葉置于28 ℃培養(yǎng)皿中黑暗培養(yǎng)24 h，將黃瓜子葉從培養(yǎng)皿中取出并拍照，利用Photoshop軟件[12]準確測量病斑面積，并將其與感病對照進行比較，病斑面積占感病對照病斑面積的0～5%（含5%）為（高抗HR）材料、占5%～20%（含20%）為（抗病R）材料、占20%～40%（含40%）為（感病S）材料、占40%以上為（高感HS）材料

1.2.3 黃瓜抗病種質(zhì)資源的篩選 用本研究建立的菌塊離體接種方法對40份黃瓜資源進行抗性鑒定，同時將其種植于田間常年多發(fā)疫病地塊，調(diào)查自然發(fā)病結果，用于比較室內(nèi)人工接種實驗結果。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和方差分析軟件進行處理和作圖，采用單因素方差分析和兩因素隨機區(qū)組法進行差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 接種方法的篩選

2.1.1 浸根法 將植株根部浸泡在孢子懸浮液中，浸泡24 h即可發(fā)病，102個孢子/mL濃度接種處理感病材料B80有6株萎蔫，根部開始出現(xiàn)水燙狀、溢縮，全部萎蔫發(fā)病率達98%；抗性材料JSH幾乎無感病癥狀，發(fā)病率為2.22%。103個孢子/mL濃度接種處理B80根部全部溢縮、萎蔫嚴重，發(fā)病率100%；JSH出現(xiàn)萎蔫癥狀，5株子葉發(fā)黃、根部無變化，發(fā)病率17.78%。104個孢子/mL濃度接種處理JSH和B80均全部萎蔫，其中B80根部開始腐爛、發(fā)病率100%，JSH根部溢縮、枯萎，發(fā)病率100%（圖1）。

圖1 浸泡法接種黃瓜抗感材料發(fā)病率Fig.1 Incidence rate of infested cucumber cultivars by soaking method

2.1.2 噴霧法 噴霧法接種JSH、B80 材料48 h后，104個孢子/mL濃度接種處理B80全部植株萎蔫，莖呈水燙狀，根部腐爛，發(fā)病率100%；JSH接種后表現(xiàn)為2/3植株呈水燙萎蔫狀，葉片呈黃色病斑發(fā)病率91%。103個孢子/mL濃度接種處理JSH的發(fā)病率為46%株，B80的發(fā)病率為100%。102個孢子/mL濃度接種處理JSH、B80無發(fā)病，但在72 h后JSH植株發(fā)病率為5.55%，B80植株發(fā)病率為97%（圖2）。

2.1.3 灌根法 用孢子懸浮液灌根接種10 d苗齡的JSH、B80，接種后3 d開始出現(xiàn)發(fā)病狀態(tài)。其中，102個孢子/mL濃度接種處理B80發(fā)病率為100%，JSH發(fā)病率為2%。103個孢子/mL濃度接種處理JSH發(fā)病率為19%，B80發(fā)病率為100%。104個孢子/mL濃度接種處理JSH發(fā)病率67%，B80發(fā)病率100%（圖3）。

圖3 灌根法接種黃瓜抗感材料發(fā)病率Fig.3 Incidence rate of infested cucumber cultivars by root pouring method

2.1.4 菌塊離體接種法 將菌塊放置于離體子葉進行接種，接種后24 h即可發(fā)病，在24～36 h調(diào)查結果比較好，這個時間能夠明確分辨出抗感差異?？剐圆牧螶SH部分葉片只在菌塊覆蓋部位出現(xiàn)點狀失綠病斑，甚至無病斑，而感病材料B80的葉片1/3～1/2葉片出現(xiàn)失綠病斑，嚴重時整片葉子開始腐爛（圖4）。

圖4 菌塊接種法接種JSH和B80 24 h后結果Fig.4 Result of inoculation of JSH and B80 for 24 hours by mycelial pellet inoculation

2.2 黃瓜抗病種質(zhì)資源篩選結果

采用菌塊離體接種鑒定方法，對40份黃瓜材料進行抗疫病鑒定。結果（表1）發(fā)現(xiàn)，根據(jù)抗病種質(zhì)資源病斑面積占感病對照病斑面積比例，PE40、PE119、PE120、PE185為相對抗病品種，占所測品種的10%，其余90%品種均感病或者高感疫病。所測40份黃瓜育種材料中，除抗病對照JSH外，沒有高抗疫病的種質(zhì)資源，該鑒定結果與田間自然發(fā)病條件結果相似，這也與以往學者“黃瓜資源抗疫病材料匱乏，華南型吊瓜類型比刺瓜類型較抗疫病”的研究結果相似。

表1 不同黃瓜種質(zhì)資源抗病性鑒定結果Table 1 Result of identification of phytophthora blight resistance of different cucumber germplasm resources

3 討論

接種鑒定是抗病育種的一個重要手段，因此建立一套方便、快捷、準確、高效的室內(nèi)鑒定方法勢必能讓抗病育種工作事半功倍。對于卵菌引起的病害常用接種鑒定方法已有較多研究[11-14]，有報道認為點滴法、灌根法、噴霧法、菌液浸泡法、注射法、涂抹法等均能在一定程度上鑒定出材料的抗感性差異，但均采用活體接種，不能保存感病材料和中間材料，不能滿足構建群體的試驗要求。其中，常用的灌根法接種接近田間發(fā)病狀態(tài)[15]，但是發(fā)病不穩(wěn)定，需要多次重復試驗才能得出可靠結果；噴霧法接種發(fā)病時間較長、發(fā)病較重，而且噴霧不均勻、噴霧量控制要求較嚴格，否則無法鑒別出抗感品種；浸根法接種植株發(fā)病快，但需要洗根，只適合少量材料的接種鑒定工作。以上3種方法及注射法、涂抹法接種都需要誘導大量疫霉菌孢子，而瓜類疫霉菌孢子難以誘發(fā)，這增加了孢子培養(yǎng)和孢子懸浮液制備的工作量，浪費人力和物力；同時，以上活體接種不能保存遺傳分析過程中的感病材料，這給抗病育種工作造成很多困擾。菌塊接種法在南瓜上已有研究[8]，但是采用活體接種無法避免材料損害問題。離體接種法在很多病害和作物上已有大量研究[16-17]；任莉等[18]比較了離體葉片接種、離體莖段接種（牙簽法）、活體莖稈接種（牙簽法）、活體葉柄接種（吸頭法）4種接種方法，測定5種油菜資源對菌核病的抗病性，結果發(fā)現(xiàn)利用移液管介導的葉柄接種是一種便捷可靠的油菜菌核病抗性鑒定方法；齊振宇等[19]采用人工氣候箱活體接種和離體葉片圓盤接種兩種方法對6個甜瓜白粉病病原菌生理小種鑒別寄主進行白粉病接種試驗，發(fā)現(xiàn)離體葉片圓盤接種法發(fā)病時間短，圓盤周圍有傷口容易被雜菌污染，從而影響了甜瓜白粉病病原菌的生長，因此不能準確分辨出材料的抗感差異；劉淼等[10]探討了離體葉片接種法鑒定野生大豆抗病性的準確性和可靠性，結果表明離體葉片接種法與下胚軸接種法之間的相關呈極顯著，且兩種方法差異不顯著，證明離體葉片接種法接種大豆疫霉根腐抗性準確可行；姚協(xié)豐等[20]研究了甜瓜鏈格孢葉斑病活體和離體接種方法，最后確定離體接種可以有效鑒定甜瓜資源的抗性?？梢?，離體接種方法在抗性鑒定中應用廣泛，根據(jù)鑒定材料和病原菌的不同，鑒定效果也有差異。本研究建立的菌塊接種法，利用微小菌塊放置于離體黃瓜子葉背面，于光照培養(yǎng)箱適宜溫度培養(yǎng)，接種培養(yǎng)24 h即可發(fā)病。發(fā)病速度快，調(diào)查時間就顯得尤為重要，應該在抗感對照差異明顯時及時記錄發(fā)病數(shù)據(jù)。另外，由于瓜類疫霉菌孢子誘導程序復雜，菌塊接種無需誘孢，而且對菌塊需求量少，利用培養(yǎng)基能夠快速、大量培養(yǎng)菌塊，大大節(jié)省了檢測過程的病原菌制備時間。

4 結論

本研究利用Photoshop軟件計算病斑面積，將感病對照與鑒定材料同時拍照，利用Photoshop軟件即能精確計算病斑面積，將病斑大小量化，易于比較。本研究建立的方法將病斑占比作為發(fā)病程度標準，綜合對照NY/T 1857-2010《黃瓜主要病害抗病性鑒定技術規(guī)程》及抗感差異的統(tǒng)計分析，將病情分級標準定為HR（高抗）、R（抗?。?、S（感?。S（高感）材料4級。如此分級不僅能夠有效區(qū)分抗感材料，而且能真實反映材料抗感水平。通過本方法鑒定的40份黃瓜材料的抗感情況與田間自然發(fā)病條件的抗感水平一致。與其他鑒定方法相比，本鑒定方法具有操作方便，鑒定時間短、能一次性大批量鑒定材料、且可保存重要種子資源等優(yōu)點。本鑒定方法以黃瓜為例，同時適用冬瓜、節(jié)瓜、南瓜等易感疫病的瓜類。