吉 薇，劉 揚，龍慧靜

（1.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東 廣州 510303；2.廣東興億海洋生物工程股份有限公司，廣東 廣州 510670；3.肇慶興億海洋生物工程有限公司，廣東 肇慶 526238）

【研究意義】扁舵鰹魚，學(xué)名稱鰹魚，又稱小金槍魚，俗稱炸彈魚，屬鱸形總目、金槍魚亞目、金槍魚科、舵鰹亞科、鰹屬。鰹魚體長達(dá)60 cm左右，與金槍魚最為相似，是世界金槍魚捕撈中最主要的目標(biāo)魚種，也是金槍魚中最廉價的魚種。鰹魚廣泛分布于各大洋的暖熱海域， 2000—2014年中西太平洋的鰹魚總產(chǎn)量為2.4793×107t，占世界總產(chǎn)量的63.9%[1]。我國南海和東海鰹魚資源也十分豐富。目前鰹魚除少數(shù)用作加工罐頭與鮮食外，大多沒有得到很好利用，資源利用率與附加值低[2]。開展鰹魚低聚肽的抗腫瘤功能研究將對鰹魚的深度開發(fā)與利用具有重大意義?！厩叭搜芯窟M展】Doyen等[3]從雪蟹副產(chǎn)物的酶解產(chǎn)物中分離出11種低聚肽，體外細(xì)胞試驗結(jié)果表明，其中4種低聚肽對A549（肺癌細(xì)胞）、BT549（乳腺癌細(xì)胞）、HCT15（腸癌細(xì)胞）和PC3（膀胱癌細(xì)胞）有抑制作用；Kuochiang等[4]從金槍魚褐色肉副產(chǎn)物的酶解產(chǎn)物中分離出2種肽（11肽和12肽），細(xì)胞試驗結(jié)果表明，這兩種肽對MCF-7（乳腺癌細(xì)胞）具有顯著的抑制作用。前人對鰹魚的研究主要集中在其營養(yǎng)成分分析[5]、罐頭加工技術(shù)[6-7]、罐頭加工副產(chǎn)物利用技術(shù)等方面[8-9]?！颈狙芯壳腥朦c】海洋生物長期生長在高壓、高鹽、缺氧等特殊環(huán)境條件下，形成了許多獨特的化學(xué)成分，展現(xiàn)了各種生物活性，被人們廣泛認(rèn)為是開發(fā)功能食品和藥物的寶貴資源。食源性海洋生物活性肽不僅具有一定的生物活性，而且具有分子量較小、易被人體吸收、生物利用率高、沒有過敏源等優(yōu)點，作為功能性食品配料具有巨大的潛力。海洋動物蛋白源活性肽具有降血壓、抗菌、抗氧化、抗炎、增強機體免疫調(diào)節(jié)功能、抗凝血等多種生物活性，已受到人們廣泛關(guān)注[10-13]。前人報道了鱈魚與金槍魚蛋白酶法制備的活性肽均具有抗腫瘤活性。扁舵鰹魚屬于金槍魚科，蛋白質(zhì)是其最主要的成分，但以鰹魚為原料酶法制備的低聚肽抗腫瘤作用尚未有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究首先采用生物酶解技術(shù)對扁舵鰹魚蛋白進行水解制備低聚肽，對其氨基酸組成及礦物質(zhì)進行分析，并測定其分子量分布，然后采用細(xì)胞培養(yǎng)實驗研究其對3種人體肝腫瘤細(xì)胞（HepG2、BEL-7402和SMMC-7721）的抑制作用，旨在為扁舵鰹魚低聚肽開發(fā)抗腫瘤輔療食品提供技術(shù)依據(jù)，研究結(jié)果對于促進扁舵鰹魚資源的深度開發(fā)與利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

扁舵鰹魚（Auxis thazard），體長50～60 cm，2017年12月購買于廣東省茂名市博賀港，置于-20℃超低溫冰箱備用；HepG2、BEL-7402與SMMC-7721 3種人體肝腫瘤細(xì)胞株由中山大學(xué)腫瘤中心提供。

試驗主要試劑：順鉑注射液購買于江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司；動物蛋白水解酶（14.5萬U/g）、風(fēng)味酶（14萬U/g）購買于南寧龐博生物工程有限公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清均為賽默飛世爾公司產(chǎn)品；噻唑藍(lán)（MTT）購于安倍醫(yī)療器械貿(mào)易（上海）有限公司；DMSO購買于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；青霉素、鏈霉素、0.25%Trypsin-EDTA 、磷酸緩沖液（PBS）由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司提供。

試驗主要儀器設(shè)備：原子吸收光譜儀（Thermo M，德國Thermo公司）、紫外分光光度計（UV-2450型，日本島津公司）、噴霧干燥器（OMLG-25，上海歐蒙實業(yè)有限公司）、立式壓力蒸汽滅菌器（HHT4-LX-C50L型，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）、管式離心機（GQ75B，上海章泉有限公司）、全自動凱氏定氮儀（FOSS 2300，瑞士FOSS公司）、臺式高速大容量冷凍離心機（艾德本中國有限公司）、熒光倒置顯微鏡（CKX41，日本奧林巴斯公司）、CO2培養(yǎng)箱（CCL-170B-8，新加坡ESCO公司）、臺式低速離心機（TDZ5-WS，湖南滬康離心機有限公司）、高效液相色譜儀（LC-20AT，美國Waters公司）、全波長酶標(biāo)儀（Multiskan GO，Thermo Fisher Scientific公司）、電子分析天平（BS224S，德國Sartouius公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 扁舵鰹魚低聚肽的制備 扁舵鰹魚去頭、去骨與內(nèi)臟，清洗、勻漿，然后在50 ℃條件下，添加動物蛋白水解酶0.5%和風(fēng)味酶0.1%，調(diào)節(jié)pH至7.5，酶解3 h，在90～100 ℃條件下加熱10 min進行滅酶，在4 000 r/min條件下離心15 min，上清液通過管式離心機（15 000 r/min）脫油，在脫油后的酶解液中添加珍珠巖進行脫色脫苦，珍珠巖添加量為3 g/100 L，靜置0.5～1.0 h，澄清液通過陶瓷膜（孔徑200 nm）過濾，然后使用截留分子量為5 000 u的超濾膜進行分離，過濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，進行噴霧干燥，噴霧干燥進口溫度為175℃，出口溫度為210℃，得到的低聚肽粉置于4℃的干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆肹14]。

1.2.2 扁舵鰹魚低聚肽分子量分布的測定 委托江南大學(xué)分析測試中心采用HPLC方法對扁舵鰹魚低聚肽分子量分布進行測定分析，具體方法參考GB/T 22492-2008。

1.2.3 扁舵鰹魚低聚肽營養(yǎng)成分與微量成分的測定 游離氨基酸參考GB/T 5009.124-2003測定；半胱氨酸、色氨酸含量按照GB/T 15400-1994測定；鈣含量參考GB/T 5009.92-2003測定；鉀與鈉含量按照GB/T 5009.91-2003測定；硒含量按照GB 5009.93-2010測定；鋅含量按照GB/T 5009.14-2003測定；能量按照GB/Z 21922-2008測定；蛋白質(zhì)含量采用自動微量凱氏定氮法測定，具體參照GB 5009.5-2010；粗脂肪含量采用索氏抽提法測定，具體參照GB/T 5009.6-2003；碳水化合物含量參照GB/Z 21922-2008測定；低聚肽含量采用高效液相色譜法測定，具體參照GB/T 22729-2008/6.3；灰分含量采用高溫灰化法測定，具體參照GB 5009.4-2010；鉛含量參照GB 5009.12-2010測定；無機砷參照GB/T 5009.11-2003測定；甲基汞含量參照GB/T 5009.17-2003測定。

1.2.4 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng) HepG2、BEL-7402與SMMC-7721肝癌細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%二氧化碳的環(huán)境中。于培養(yǎng)瓶中加入DMEM完全培養(yǎng)液，待細(xì)胞長至80%～90%匯合時，棄去原培養(yǎng)液，PBS漂洗后，棄 PBS，加入 0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化細(xì)胞，加適量 DMEM完全培養(yǎng)液終止消化，800～1 000 r/min 離心 5～10 min 后棄上清，加入適量 DMEM完全培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞，輕輕混勻，按適當(dāng)比例接種到培養(yǎng)瓶。對傳代細(xì)胞觀察3 d。期間每天檢查細(xì)胞1次，細(xì)胞未見異常，培養(yǎng)液未見異常，該株細(xì)胞納入實驗。

1.2.5 扁舵鰹魚低聚肽對肝癌細(xì)胞的抑制作用 扁舵鰹魚低聚肽對人體3種肝癌細(xì)胞的抑制作用委托廣東省實驗動物醫(yī)學(xué)中心測定。扁舵鰹魚低聚肽對肝癌細(xì)胞抑制作用研究的樣品添加情況如表1所示。采用DMEM完全培養(yǎng)液分別培養(yǎng)HepG2、BEL-7402與SMMC-7721細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到其對數(shù)生長期末細(xì)胞趨于融合時，用0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化細(xì)胞，HepG2、BEL-7402與SMMC-7721細(xì)胞分別用DMEM完全培養(yǎng)液制成3×104、3×104、4×104個/mL的細(xì)胞懸液，3種肝癌細(xì)胞接入量每孔分別為3 000、3 000、4 000個；將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3孔，每孔100 μL，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的樣品、不同濃度的樣品+順鉑注射液、順鉑注射液和培養(yǎng)液，每孔200 μL（表1），置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后在顯微鏡（100 ×）下觀察細(xì)胞形態(tài)；棄去孔內(nèi)液體，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩，甲瓚溶解均勻后，用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度，測定波長為570 nm。供試品對3種人體肝腫瘤細(xì)胞的抑制率按下列公式進行計算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗各處理重復(fù)3次，數(shù)據(jù)使用SPSS19.0和 Excel 2013進行顯著性分析和數(shù)據(jù)處理，用Origin8.5進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 扁舵鰹魚低聚肽分子量分布

生物活性肽的活性大小與其分子量緊密相關(guān)，分子量低于5 000 u的肽，尤其是二肽與三肽具有高的生物活性[15]。從表2可知，扁舵鰹魚低聚肽分子量集中在1 000 u以下的組分，占比89.79%。其中分子量1 000～500 u的組分占比22.22%，分子量500～180 u的組分占比45.77%，分子量小于180 u的組分占例21.80%。分子量500～180 u的組分占比最大，其數(shù)均分子量和重均分子量分別為245 u和267 u。結(jié)果表明，扁舵鰹魚低聚肽主要是小分子肽，分子量180～1 000 u的肽占比67.99%，二肽與三肽占總肽的45.77%。

表1 96孔培養(yǎng)板各處理加樣情況Table 1 The scheme of adding samples to 96-well plates

表2 扁舵鰹魚低聚肽分子量分布Table 2 Molecular weight distribution of Auxis thazard oligopeptide

2.2 扁舵鰹魚低聚肽氨基酸組成與含量

生物活性肽的活性大小不僅與其分子量有關(guān)，而且與其氨基酸組成也有緊密關(guān)系[16]。表3顯示，扁舵鰹魚低聚肽中，氨基酸含量高達(dá)95.91%，人體所需的8種/9種必需氨基酸組成均衡，尤其是谷物中缺乏的賴氨酸含量高，達(dá)到每100 g 含10.61 g賴氨酸，因此扁舵鰹魚低聚肽是人體良好的蛋白質(zhì)來源。組成扁舵鰹魚低聚肽的氨基酸中，與免疫調(diào)節(jié)活性及抗氧化活性緊密相關(guān)的谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、精氨酸含量都高，5種氨基酸占總氨基酸的52.41%[17]。

表3 扁舵鰹魚低聚肽粉中氨基酸的含量Table 3 Contents of amino acids in Auxis thazard oligopeptide

2.3 扁舵鰹魚低聚肽營養(yǎng)成分與微量成分的含量

扁舵鰹魚低聚肽基本營養(yǎng)成分如表4所示，主要成分為蛋白質(zhì)，占總干重的88.90%，每100 g能量為1 567 kJ/100 g，含低聚肽量71.96 g、灰分4.8 g，是一種典型的高蛋白、低脂肪食品配料。扁舵鰹魚低聚肽礦物質(zhì)含量豐富，尤其是硒與鋅2種微量元素含量高?！吨袊用裆攀碃I養(yǎng)素參考攝入量》中規(guī)定成人硒推薦攝入量每天為50 μg，而國際營養(yǎng)科學(xué)會推薦富硒食品每 100 g中含硒 0.04～0.15 mg[18]。每 100 g扁舵鰹魚低聚肽中含硒2.84 mg，可以作為人體攝入硒元素的良好來源?！吨袊用裆攀碃I養(yǎng)素參考攝入量》中規(guī)定成人鋅的每天生理需要量男性平均為1.0 mg，女性為0.7 mg[19]。每100 g扁舵鰹魚低聚肽中鋅含量為10.1 mg，是人體攝入鋅的良好來源。其他有害元素（鉛、砷、汞、鎘）均小于0.1%，符合國家相關(guān)食品標(biāo)準(zhǔn)。

表4 扁舵鰹魚低聚肽（每100 g）中的營養(yǎng)成分和微量元素含量Table 4 Contents of nutrients and trace elements in Auxis thazard oligopeptide (per 100 g)

2.4 扁舵鰹魚低聚肽對3種人體肝癌細(xì)胞的抑制作用

前人研究表明，HepG2、BEL-7402和SMMC-7721這3種肝癌細(xì)胞是研究肝癌細(xì)胞抑制作用的最常用類型[20-21]。為了考察扁舵鰹魚對HepG2、BEL-7402與SMMC-7721肝癌細(xì)胞的抑制作用，運用96孔板對肝癌細(xì)胞進行培養(yǎng)，將試驗分為9個處理，陰性對照，陽性對照（添加10 μg/mL順鉑注射液），順鉑給藥處理（添加0.5 μg/mL），扁舵鰹魚低聚肽高、中、低劑量處理以及與順鉑聯(lián)合給藥的高、中、低劑量處理，培養(yǎng)48 h，采用熒光倒置顯微鏡觀察 3種肝癌細(xì)胞的形態(tài)，采用MTT法檢測每孔吸光度，計算腫瘤抑制率，結(jié)果分別如圖1、圖2、圖3所示。 從圖1（A）可以看出，與陰性對照比較，其余各處理細(xì)胞數(shù)都有不同程度減少，其中陽性對照、扁舵鰹魚低聚肽高劑量處理、扁舵鰹魚低聚肽高劑量與順鉑聯(lián)合給藥處理細(xì)胞數(shù)最少，說明這3個處理添加物對HepG2細(xì)胞的抑制效果顯著；從圖1（B）可以看出，與陰性對照比較，陽性對照、扁舵鰹魚低聚肽高劑量處理、扁舵鰹魚低聚肽高劑量與順鉑聯(lián)合給藥處理細(xì)胞抑制率極顯著增高, 除扁舵鰹魚低聚肽低劑量處理外，其余各處理細(xì)胞抑制率也顯著增高。上述結(jié)果表明，扁舵鰹魚低聚肽對HepG2具有顯著抑制作用（IC50為10.243 mg/mL），其抑制效應(yīng)具有劑量關(guān)系；扁舵鰹魚低聚肽聯(lián)合順鉑給藥處理雖然IC50（6.815 mg/mL）有所下降，但沒有展現(xiàn)出明顯的增敏效應(yīng)。圖2（A）與圖1（A）、圖2（B）與圖1（B）展現(xiàn)了相似的規(guī)律，說明扁舵鰹魚低聚肽對BEL-7402細(xì)胞也具有顯著的抑制作用（IC506.042 mg/mL），且具有劑量關(guān)系，其抑制效果較陽性對照差，但高劑量處理較順鉑注射液處理好，聯(lián)合順鉑給藥也沒有展現(xiàn)出增敏效應(yīng)。圖3（A）與圖1（A）、圖2（A）也展現(xiàn)了類似規(guī)律，說明扁舵鰹魚低聚肽對SMMC-7721細(xì)胞也具有顯著抑制作用（IC508.432 mg/mL），并且具有劑量關(guān)系，其抑制效果較陽性對照差，但均較順鉑注射液處理好，聯(lián)合順鉑給藥也沒有展現(xiàn)出增敏效應(yīng)。

圖1 扁舵鰹魚低聚肽對人肝癌細(xì)胞HepG2生長的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of Auxis thazard oligopeptide on the growth of human hepatocellular carcinoma cell HepG2

圖2 扁舵鰹魚低聚肽對人肝癌細(xì)胞BEL-7402生長的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Auxis thazard oligopeptide on the growth of human hepatocellular carcinoma cell BEL-7402

圖3 扁舵鰹魚低聚肽對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721生長的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of Auxis thazard oligopeptide on the growth of human hepatocellular carcinoma cell SMMC-7721

3 討論

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，生物活性肽的活性高低不僅與其氨基酸組成和排列順序相關(guān)，而且與分子量大小關(guān)系密切，不同分子量的肽展現(xiàn)出不同的生物活性，具有較高活性的肽主要集中在3 000 u以下[22-24]。Abdul等[15]從鰻魚蛋白水解物中提取多肽，研究表明，抗癌活性和抗氧化活性較高時，肽的分子量范圍在3 000～5 000 u之間。Stuknyte等[25]從牛乳乳酸菌發(fā)酵液中分離出不同組分的多肽，其中小于3 000 u的分子量組分能顯著降低Caco-2細(xì)胞中NF-kB因子的活性，免疫調(diào)節(jié)功能較強。低聚肽一般由2～20個氨基酸組成，具有抗癌活性的肽國內(nèi)外報道文獻較多，但對于抗腫瘤肽的活性與其氨基酸組成之間的關(guān)系鮮見報道?；钚噪膮⑴c抗氧化、增強免疫、抗擴散、抗微管蛋白和細(xì)胞毒活性等各種生理功能，這些活性可能賦予其具有抗癌的潛力[26]。Udenigwe等[16]報道，組氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、蛋氨酸和芳香氨基酸具有良好的清除自由基能力。張英等[17]報道，亮氨酸、谷氨酸、精氨酸和蛋氨酸具有較強的清除O2-和OH-活力的能力，是調(diào)節(jié)免疫活性的功能性氨基酸。

海洋動物蛋白水解物或肽的抗癌活性隨原料來源、酶解條件、供試腫瘤細(xì)胞不同而異。Picot等[27]報道，分子量小于7 000 u的藍(lán)鱈、三頭鱈與鮭魚酶解產(chǎn)物對MCF-7/6和MDA-MB-231細(xì)胞均具有顯著的抑制作用；Aleman等[28]報道，珍寶烏賊皮膠原的酶解產(chǎn)物對MCF-7和U87細(xì)胞具有抑制作用，其IC50分別為0.13、0.10 mg/mL；Naqash等[29]報道，日本無患子和飛魚的酶解產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞均具有顯著的抑制效果，其抑制率分別為48.5 mg/mL和21.6 mg/mL。扁舵鰹魚低聚肽分子量集中在3 000 u以下，對HepG2、BEL-7402與SMMC-7721肝癌細(xì)胞均具有抑制作用，說明其抗肝癌具有廣譜性，展現(xiàn)了抗肝癌的巨大潛力，對3種肝癌細(xì)胞的IC50值分別為10.243、6.042、8.432 mg/mL，均較文獻[29]報道的IC50值小。

目前測定海洋動物蛋白肽抗癌活性的方法主要有體外和體內(nèi)兩種，體外方法主要采用細(xì)胞培養(yǎng)試驗，具有簡單、快速等優(yōu)點，但與體內(nèi)結(jié)果差異較大。體內(nèi)主要通過動物實驗來評價，結(jié)果可靠，但費用高、時間周期長。目前文獻報道抗癌肽的活性大多采用細(xì)胞培養(yǎng)試驗進行測定，采用的樣品大多都是肽混合物，對于其抗癌作用機制研究甚少。本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)試驗證實了扁舵鰹魚低聚肽對3種肝癌細(xì)胞均有顯著抑制作用，但其體內(nèi)抗癌活性以及抗癌肽結(jié)構(gòu)的闡明與作用機制尚需進一步研究。

4 結(jié)論

扁舵鰹魚蛋白采用復(fù)合酶水解與膜分離技術(shù)相結(jié)合制備的低聚肽主要是小分子肽，其中分子量1 000 u以下的占67.99%，分子量180～500 u的二肽與三肽占45.77%；人體所需的8種/9種必需氨基酸組成均衡，與免疫調(diào)節(jié)活性及抗氧化活性緊密相關(guān)的5種氨基酸含量豐富、占52.41%；硒和鋅含量高。細(xì)胞培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，扁舵鰹魚低聚肽對3種人體肝腫瘤細(xì)胞（HepG2、BEL-7402與SMMC-7721）均具有顯著抑制作用，并具有劑量效應(yīng)。本研究結(jié)果為扁舵鰹魚低聚肽開發(fā)抗腫瘤輔療食品提供了技術(shù)依據(jù)，對于促進扁舵鰹魚資源的深度開發(fā)與利用具有重要意義，但其體內(nèi)抗癌活性與作用機制尚需進一步研究。