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阿爾茨海默病生物標志物及其檢測技術(shù)研究概況

徐志強1齊鵬楊曉慶2李萬里3

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院，河南新鄉(xiāng)453003)

關(guān)鍵詞〔〕阿爾茨海默??；生物標志物

1蘇州大學附屬第二醫(yī)院2平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院

3新鄉(xiāng)醫(yī)學院免疫學教研中心

第一作者：徐志強(1989-)，男，碩士，主要從事神經(jīng)退行性疾病研究。

阿爾茨海默病(AD)表現(xiàn)為逐漸加重的近期記憶缺失，而遠期記憶則相對不受病情進展的影響。隨著病情的加重，逐漸出現(xiàn)記憶力減退、認知功能障礙、行為異常和社交障礙。AD的病理改變主要累及大腦皮質(zhì)、海馬、前腦等區(qū)域，以淀粉樣血管病及神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)、神經(jīng)細胞喪失、細胞外淀粉樣肽沉積、神經(jīng)炎斑或老年斑形成為特征改變。目前，臨床上仍沒有有效的藥物和臨床途徑可治愈AD，早期發(fā)現(xiàn)AD并在臨床前期阻斷或延緩AD的病理生理變化，患者的生活質(zhì)量將會顯著提高。本文就早期AD相關(guān)生物標志物及其檢測技術(shù)作一綜述。

1蛋白質(zhì)組學分析技術(shù)

1.1二維聚丙烯酰胺凝膠電泳分析二維電泳技術(shù)的發(fā)明始于1975年的O'Farrel,二維電泳技術(shù)將等電聚焦與十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)相結(jié)合,利用蛋白質(zhì)的等電點及分子量的差異對混合蛋白樣品進行分離，優(yōu)于兩者單獨使用分離效果。Li等〔1〕采用二維凝膠電泳和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素-亮氨酸藍藻派生-精氨酸(MCLR)引起的神經(jīng)毒性與球蛋白相關(guān)，并認為MCLR引起的神經(jīng)毒性可能與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。Yang等〔2〕采用二維凝膠電泳結(jié)合納米高性能液體色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(nano-HPLC-ESI-MS/MS)分析AD患者血清蛋白中肽碎片，并對6個差異表達的蛋白斑點進行鑒定。發(fā)現(xiàn)在AD患者血清中跨α-胰蛋白酶抑制劑重鏈p、載脂蛋白A-Ⅳ、肌動蛋白、α-1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶Ⅲ這五種蛋白表達增強。Ciavardelli等〔3〕通過采用二維凝膠電泳和質(zhì)譜研究三重轉(zhuǎn)基因小鼠AD模型(3xTg-AD)轉(zhuǎn)基因小鼠和早老素-1基因敲除〔動物蛋白的表達發(fā)生改變但不發(fā)展為β淀粉樣蛋白(Aβ)-tau蛋白依賴的病理，也不表現(xiàn)認知能力下降，作為對照〕的小鼠。發(fā)現(xiàn)前者參與糖代謝和蛋白質(zhì)分解代謝的蛋白質(zhì)的表達上調(diào)。其研究結(jié)果對突變淀粉樣前體蛋白和磷酸化的tau蛋白的機制闡述有一定的幫助。Chou等〔4〕使用二維差異凝膠電泳和串聯(lián)質(zhì)譜定量測定進行比較蛋白質(zhì)組學定量分析的方法，對3xTg-AD小鼠的線粒體蛋白質(zhì)組的變化進行分析，發(fā)現(xiàn)線粒體相關(guān)蛋白在3xTg-AD和非轉(zhuǎn)基因小鼠之間大腦皮層23種不同的蛋白質(zhì)的表達水平差異顯著。

1.2氣相和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS和LC-MS/MS)分析液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)，經(jīng)純化后的樣品在液相色譜和質(zhì)譜部分進行分離和離子化，經(jīng)由檢測器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用利用了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，結(jié)合了色譜對復雜樣品的高分離能力和質(zhì)譜的高選擇性，高靈敏度及能夠提供相對分子量和結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點。它對化合物的結(jié)構(gòu)破壞性很小，因而，適合生物分子和有機分子的分離。與其他分析方法相比，質(zhì)譜具有更高的靈敏度，對未知分子結(jié)構(gòu)的定性分析也很準確，對標準樣品相對于其他分析方法，要求相對較低。質(zhì)譜可與高效液相色譜聯(lián)用如(HPLC/MS),亦可和氣相聯(lián)用如GC/MS。因為質(zhì)譜和色譜靈敏度基本相同，質(zhì)譜的進樣系統(tǒng)可以用分離效果很好的色譜來實現(xiàn)，質(zhì)譜作為色譜的鑒定儀也有分離好，速度快，應用廣等優(yōu)點。Czech等〔5〕通過采用GC-MS和LC-MS/MS配合單變量和多變量統(tǒng)計分析法對79例AD患者和51名健康對照者腦脊液標本分析 ，AD患者與健康對照組相比共有343種蛋白有表達差異。另外，皮質(zhì)醇水平升高似乎與AD的發(fā)展相關(guān)。 AD的嚴重程度與半胱氨酸水平增加和尿苷水平下降相關(guān)，且他們是最好的配對組合。Hu等〔6〕使用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)，對野生型C57BL/6J小鼠和 TASTPM小鼠腦脊液和血漿進行比對， TASTPM小鼠腦脊液中(D-果糖、L-纈氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸)和血漿中(D-葡萄糖、D-半乳糖、亞油酸、花生四烯酸代謝產(chǎn)物、棕櫚酸、D-葡糖酸)發(fā)生紊亂。Vanmierlo等〔7〕應用氣相色譜/質(zhì)譜分析，對植物甾醇與AD組(n=67)和對照組(n=29)的患者血漿和腦脊液中濃度測定。發(fā)現(xiàn)AD患者腦脊液中Brassicasterol蛋白顯著降低，因此，Brassicasterol蛋白可能是一個與AD有關(guān)的生物標志物。

1.3鳥槍法蛋白組學鳥槍法在基因組測序時,先將DNA打斷,分段測序,然后利用計算機將片段重組在一起,確定生物的基因組序列。鳥槍法在蛋白組研究應用與其相似,先將蛋白混合物降解成肽段,再用質(zhì)譜進行分析測序,最后計算機根據(jù)設(shè)定好的運算法則描繪出肽段在蛋白質(zhì)上的位置圖譜,確定該混合物中的蛋白成分。Shevchenko等〔8〕通過鳥槍法比較Tg2576模型的腦蛋白質(zhì)組。對1 085種蛋白質(zhì)進行鑒定和縱向量化。確定了57種年齡依賴性的線粒體蛋白表達減少，其中的一些蛋白與AD的發(fā)生相關(guān)。Han等〔9〕通過多維質(zhì)譜為基礎(chǔ)的鳥槍脂類組學進行前瞻性分析，確定超過800種脂類分子水平，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E4基因型與認知表現(xiàn)相關(guān)。

1.4基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)分析法基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜的主要用途有：對生物大分子物質(zhì)分子量的測定，對蛋白質(zhì)進行高通量的鑒定，對有機小分子化合物分子量的測定，對寡核苷酸的分析，對基因的單核苷酸多態(tài)性的分析等。目前在AD相關(guān)蛋白的測定中已經(jīng)起到了一定的作用。淀粉樣肽的蛋白水解加工在AD的形成過程中起到重要作用，淀粉樣肽的蛋白水解控制大腦Aβ水平。Taki〔10〕通過薄層色譜(TLC)-印跡/基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)系統(tǒng)(MS)建立了一個新的糖和脂類組學方法，發(fā)現(xiàn)AD患者海馬灰質(zhì)神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b GT1B的水平比帕金森病和正常對照組的水平有所降低。他們認為AD是一種受海馬區(qū)神經(jīng)節(jié)苷脂代謝性影響的疾病。

2腦脊液(CSF)中AD的生物標志物

2.1tau蛋白神經(jīng)細胞骨架的主要成分是微管系統(tǒng)，對細胞功能的維持起重要作用，微管由α、β微管蛋白和微管相關(guān)蛋白組成。tau 蛋白是一種微管結(jié)合蛋白(MAP)，與微管結(jié)合并保持微管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。微管蛋白與tau蛋白結(jié)合作為早期微管組裝核心，從而促進其他微管蛋白在此核心上延伸聚集形成微管。tau 蛋白的微管結(jié)合能力主要由絲氨酸、蘇氨酸磷酸化來調(diào)節(jié)〔11〕。

Sj?gren等〔12〕發(fā)現(xiàn)AD患者與年齡匹配的對照受試者相比隨著年齡的增加CSF總tau水平顯著提高。并發(fā)現(xiàn)90%以上研究對象的CSF中tau蛋白水平升高的輕度認知障礙(MCI)會轉(zhuǎn)變?yōu)锳D。tau蛋白的水平可能是由MCI轉(zhuǎn)變?yōu)锳D的標志物。Zetterberg等〔13〕通過對不同的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病CSF生物標志物的水平變化分析發(fā)現(xiàn)AD患者CSF中總tau蛋白，過磷酸化tau蛋白水平升高，而Aβ1～42的水平降低。Blasko等〔14〕通過評估CSF水平的13個潛在的生物標志物在治療AD、額顳葉癡呆癥、酒精性癡呆、抑郁癥和無任何神經(jīng)精神疾病的對照組中的作用，發(fā)現(xiàn)P-tau181/Aβ42的比值比越高患AD的概率越大。Humpel〔15〕通過研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，AD體內(nèi)CSF的總tau蛋白和P-tau蛋白增加。并發(fā)現(xiàn)tau蛋白磷酸化蘇氨酸231可提高AD和額顳葉癡呆的區(qū)分，tau蛋白磷酸化絲氨酸181提高AD和路易體癡呆之間的區(qū)分。Mattsson等〔16〕通過對大樣本研究，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加AD患者CSF中Aβ1～42減少，總tau增加，tau蛋白磷酸化增加。

2.2Aβ淀粉樣蛋白斑的主要組成部分是4 kD的Aβ，它代表一個37～43-氨基酸的Aβ種類，Aβ40，即組成主要種類的疏水性肽的非均相混合物。更長的變種Aβ42和Aβ43具有高度聚集傾向。最近證明，Aβ42以及Aβ43是高致病性的，認為會通過觸發(fā)一系列的事件導致AD，神經(jīng)退行性疾病和老年癡呆癥最終導致所謂的淀粉樣蛋白級聯(lián)致病。 Aβ是由β-淀粉樣蛋白前體蛋白的水解加工，在Ⅰ型膜蛋白，β-分泌酶和γ-分泌酶的聯(lián)合作用產(chǎn)生的〔17〕。Stefani等〔18〕通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)， CSF的生物標記物Aβ1～42、T-tau蛋白、總tau蛋白和tau蛋白磷酸化蘇氨酸181可鑒別AD和血管性癡呆。并且AD患者Aβ1～42的水平非常低。Noguchi等〔19〕通過評估CSF-tau蛋白，CSF-Aβ42和CSF-ptau的進行性核上性麻痹(PSP)和皮質(zhì)基底節(jié)變性(CBD)的生化指標，研究對象為18例PSP，CBD的9例，69例AD和43名對照者。發(fā)現(xiàn)在AD患者CSF中Aβ1～42水平顯著下降。CSF中的Aβ1～42和高總tau蛋白的低水平可作為AD的診斷。Gustafson等〔20〕在1992～2002年通過對55名婦女(年齡70～84歲)的縱向調(diào)查，結(jié)果顯示，Aβ42是預測認知功能下降或癡呆癥的唯一指標。Pesaresi等〔21〕通過對146例散發(fā)性AD患者，89例MCI和89例年齡匹配的對照的血漿Aβ1～42水平的比較。發(fā)現(xiàn)AD患者有顯著較低的水平。Aβ1～42的減少可能是AD狀態(tài)的一個標記，具體而言，從正常狀態(tài)或MCI到AD的過渡，而不是發(fā)生在疾病的神經(jīng)變性過程的一個標記。

3血液中AD的生物標志物

3.1淀粉樣前體蛋白和Aβ由淀粉樣前體蛋白的順序裂解所致β-淀粉樣肽的分泌被普遍認為是AD因果關(guān)系的基礎(chǔ)。Mayeux等〔22〕通過對530例參與老化和老年癡呆癥患者的流行病學研究，發(fā)現(xiàn)血漿Aβ40和Aβ42的水平與年齡相關(guān)，在一些患者體內(nèi)血漿Aβ40和Aβ42的水平較高，但之后都降低了，高血漿水平的Aβ42可能與AD患者的死亡率有關(guān)。Pomara等〔23〕通過對34例老年受試者的血漿Aβ40和Aβ42水平與認知功能下降的研究發(fā)現(xiàn)，血漿Aβ42水平可能和老年人的認知下降水平有關(guān)。van Oijen等〔24〕通過對6 713例參加的癡呆風險研究，隨機抽取了1 756例進行記錄。在隨訪期間(平均8.6年)，對392例癡呆進行了鑒定。調(diào)查Aβ的血漿濃度和癡呆癥的風險及其亞型的Cox比例風險模型之間的關(guān)聯(lián)。發(fā)現(xiàn)高血漿濃度的Aβ40，尤其是在血漿Aβ42水平降低時，AD的發(fā)生風險增高。Graff-Radford〔25〕等通過對563例認知能力正常的志愿者(平均年齡78歲，62%為女性)使用酶聯(lián)免疫吸附試驗，血漿Aβ40和Aβ42水平隨訪2～12(平均3.7)年，進行隊列分析檢測MCI和AD的發(fā)病病例。發(fā)現(xiàn)在隨訪期間53名受試者發(fā)生了MCI或AD，回歸分析結(jié)果顯示，血漿Aβ42與Aβ40的比值降低和認知能力的降低顯著相關(guān)。

3.2載脂蛋白(Apo)ApoE基因在人類中，存在ε2，ε3和ε4 3種不同的多態(tài)性等位基因。ε4等位基因頻率在一般人群中是0.15，但AD患者中是0.4〔26〕。ε4等位基因與AD的發(fā)生風險相關(guān)聯(lián)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中ApoE基因編碼的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)結(jié)合對于膽固醇運輸是至關(guān)重要的。因此，膽固醇運輸?shù)母蓴_ApoEε4等位基因攜帶者患AD風險可能增加。

Soares等〔27〕通過對396例MCI患者，112例AD患者和58例健康對照的研究發(fā)現(xiàn)，所有具有Apo ε 3/ε4 或 ε4/ε4基因的參與者都表現(xiàn)出明顯的生化特征：低C-反應蛋白水平，高皮質(zhì)醇，高白細胞介素(IL)13，高ApoB及高γ-干擾素。并認為ApoB可能作為AD和ACI的篩選工具。Song等〔28〕對664例(257例MCI，407例認知正常)平均年齡78歲的參與者隨訪兩年以上，發(fā)現(xiàn)血漿中低水平的ApoA1、ApoA2、ApoH和高水平的ApoE和ApoJ，ApoB/ApoA1的高比值。ApoEε4等位基因攜帶者血漿ApoE、ApoC3、ApoH水平較高，但是具有較低水平的ApoB。他們發(fā)現(xiàn)具有較高水平的ApoA1、ApoA2、ApoH且ApoB/ApoA1比率升高者將更有可能發(fā)生認知能力降低。Doecke等〔29〕通過對一個擁有754例正常個體作為對照和207例AD患者進行研究，發(fā)現(xiàn)在AD患者體內(nèi)皮質(zhì)醇、胰多肽、胰島素樣生長因子、結(jié)合蛋白2、微球蛋白、血管細胞黏附分子1、癌胚抗原、基質(zhì)金屬蛋白酶2、CD40、巨噬細胞炎性蛋白1α、超氧化物歧氧化物歧化酶和同型半胱氨酸標記物的顯著增加和表皮生長因子受體、ApoE、血紅蛋白、鈣、鋅、IL17、白蛋白下降。

3.3炎性反應因子在AD患者血漿中可以檢測到一些炎癥因子，表明炎癥在AD病理發(fā)展過程中有一定作用，隨著小膠質(zhì)細胞的激活一些細胞趨化因子也隨之產(chǎn)生,進而誘導產(chǎn)生巨球蛋白等，IL又可以誘導一氧化氮合酶，最終以氧化應激損傷神經(jīng)元。Engelhart等〔30〕對AD患者的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-1和IL-6的血漿水平較高的老年受試者發(fā)生癡呆的風險增加。Tan等〔31〕研究，分析外周血細胞釋放細胞因子，較高程度的外周血單核細胞釋放IL-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α，增加了發(fā)生AD的風險。Pratico等〔32〕通過實驗證明，血漿游離體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的特異性標記物：8，12-iso-iPF(2α)-Ⅵ在體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化作用，從而增加AD和MCI的發(fā)病概率。

4AD相關(guān)的候選生物標志物

Wang等〔33〕使用GC-MS技術(shù)加上多元統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)二十二碳六烯酸很有可能作為AD診斷的潛在生物標記物。任進民等〔34〕采用高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)檢測20例AD患者和29例正常對照老年人血漿，發(fā)現(xiàn)AD患者血漿中脫氫表雄酮硫酸酯含量降低對診斷老年性癡呆有較高的敏感性和特異性,有一定的臨床應用價值,脫氫表雄酮硫酸酯可作為AD的一項早期診斷指標。 Li等〔35〕對AD 患者和健康老年人血漿進行分析，發(fā)現(xiàn)溶血卵磷脂，鞘氨醇和色氨酸可作為診斷AD潛在的生物標志物。Greenberg等〔36〕發(fā)現(xiàn)AD患者血漿中3種膽汁酸含量增加，并提示進一步的代謝組學分析可能會發(fā)現(xiàn)診斷AD更有價值的生物標記物。Salek等〔37〕對轉(zhuǎn)基因小鼠TgCRND8 8個大腦區(qū)域(大腦皮質(zhì)、額葉皮層、小腦、海馬、嗅球、腦橋、中腦和紋狀體)進行研究，在觀察的TgCRND8 老鼠內(nèi)發(fā)現(xiàn)：海馬，額葉皮層(異常γ-氨基丁酸)這些區(qū)域的相應加載圖分析表明，N-乙?；?L-天門冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、?；撬?海馬例外)、γ-氨基丁酸、膽堿、磷酸膽堿(合并的共振)、磷酸肌酸、肌酸和琥珀酸減少；海馬皮質(zhì)、額葉皮層(異常γ-氨基丁酸)乳酸(除了在中腦)、天門冬氨酸、甘氨酸及其他氨基酸包括丙氨酸(額葉皮層例外)，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸和水溶性游離脂肪酸增加。這些改變可增強診斷和監(jiān)測AD。Tukiainen等〔38〕研究了180份血清樣品，其中30%為MCI(神經(jīng)心理診斷嚴重AD的風險增加)，發(fā)現(xiàn)Ω-3 脂肪酸和糖蛋白的改變能增加AD 發(fā)病風險，支持炎癥和代謝綜合征并存時能夠形成使認知功能下降的高危環(huán)境的觀點。Kaddurah-Daouk等〔39〕對15 例AD 患者CSF進行檢測，發(fā)現(xiàn)酪氨酸、色氨酸、嘌呤、生育酚等物質(zhì)的改變，去甲腎上腺素和其相關(guān)的代謝物減少，并分析了酪氨酸、色氨酸、嘌呤、生育酚等物質(zhì)的代謝路徑。需要進一步對這些生物標記物做大樣本AD人群的代謝組學研究，以期能夠更好地預測臨床前期疾病。

綜上，近年來一些新技術(shù)的開發(fā)使用，更加促進了蛋白組學的研究，基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)，高效液相色譜與電感耦合等離子質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)，液相色譜-紫外光譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-UV-MS),熒光差異顯示雙向電泳技術(shù)AKTA層析技術(shù)表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF),鳥槍法蛋白質(zhì)組學等對蛋白的分離、定性和定量的檢測，將有助于新的AD生物標記物的發(fā)現(xiàn)。

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〔2014-07-12修回〕

(編輯杜娟)

通訊作者：李萬里(1955-)，男，教授，碩士生導師，主要從事神經(jīng)退行性疾病免疫學機制研究。

中圖分類號〔〕R741〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6317-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.148