孫啟玉 賈興旺 田亞平 (承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，河北 承德 067000)

目前研究表明急性心血管事件發(fā)生的主要原因是冠狀動脈粥樣硬化(AS)斑塊的破裂、出血、血栓形成，而和冠狀AS的嚴重程度不成正比。冠狀AS斑塊的鈣化是其病理發(fā)生到一定程度的表現(xiàn)。鈣化使斑塊變硬、變脆，容易碎裂導致急性心血管事件的發(fā)生。

1 AS斑塊鈣化與心血管事件

病理學上認為AS斑塊鈣化發(fā)生時，在鈣化與非鈣化交界面由于不同的組織密度使其容易受壓破裂?，F(xiàn)在越來越多的證據表明鈣化可作為AS斑塊穩(wěn)定性的獨立預測指標，對冠脈事件的發(fā)生有預測價值。Shemesh等〔1〕對穩(wěn)定型冠心病患者隨訪觀察發(fā)現(xiàn)CAC(CAC)積分隨時間進展變化。冠狀動脈鈣化對有癥狀患者的預測能力得到了廣泛研究。Georgiou等〔2〕對192例病人進行隨訪研究50個月，發(fā)現(xiàn)CAC積分和冠脈事件的發(fā)生密切相關，高積分病人發(fā)生不良事件的風險是低或零積分病人的13.2倍。在一項對458例有急性胸痛且排除急性冠脈綜合征(ACS)的病人研究中，有AS斑塊鈣化的病人比無鈣化者更易發(fā)生心血管不良事件，其危險比(HR)分別是86.96與58.06〔3〕。對穩(wěn)定型心絞痛病人，Rijlaarsdam-Hermsen 等〔4〕的研究表明，CAC積分為陰性的病人在隨訪44個月時無不良事件的發(fā)生，其陰性預測價值是100%。CAC對于無癥狀病人冠脈事件也有很好的預測能力。一項5 000余例患者的前瞻性觀察研究發(fā)現(xiàn)，與CAC積分＜100的患者相比，＞100的患者4.3年后發(fā)生冠脈事件的相對危險度為9.5～10.7〔5〕。Budoff等〔6〕對無癥狀患者的研究也發(fā)現(xiàn)死亡率與CAC積分呈正相關。

鑒于大量有關AS斑塊鈣化與不良事件發(fā)生風險的文獻報道。2005美國心臟學會的一份關于臨床檢測女性冠狀動脈疾病的聲明寫到低CAC和低不良事件發(fā)生風險相關，高CAC預示高風險的不良事件。建議對Framingham評分為中度的病人用CAC來評價AS負荷〔7〕。歐洲心血管指南也寫到CAC積分是無癥狀患者未來發(fā)生心血管事件風險評價的重要指標，并獨立于傳統(tǒng)的風險因素〔8〕。

2 AS斑塊鈣化形成機制及危險因素

以前人們認為血管鈣化是磷酸鹽礦物質在壞死組織沉積形成的，近年來研究表明AS鈣化是一種與新骨形成極為相似的受調控的主動性代謝過程，其鈣鹽的主要成分是羥磷灰鈣，而不是原來認為的磷酸鈣。AS鈣化出現(xiàn)較早，亞臨床的AS早期就出現(xiàn)了骨相關蛋白的表達，當脂質條紋形成時，組織學上就可以檢測到鈣化的存在〔8〕。

血管平滑肌細胞(VSMC)表型的改變認為是AS鈣化的關鍵步驟。Bobryshev等〔9〕用電鏡觀察 ApoE基因敲除鼠 AS模型，發(fā)現(xiàn)AS脂質斑塊周圍的平滑肌細胞表現(xiàn)出軟骨樣細胞特征，在細胞間隙有許多含有羥磷灰石結晶的小囊泡出現(xiàn)，認為平滑肌細胞分化為軟骨細胞，導致了斑塊鈣化的形成。發(fā)生表型轉換的平滑肌細胞可持續(xù)表達和鈣化相關的核因子(NF)-κB受體活化因子配體(RANKL)、核結合因子 α1(Cbfα1，Runx2)、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素、堿性磷酸酶及骨保護素(OPG)等〔10，11〕。這些蛋白調節(jié)骨基質的形成，參與鈣化。

炎癥和AS斑塊鈣化的發(fā)生有關。脂質過氧化產物的沉積及氧化應激參與粥樣斑塊的形成。炎癥反應導致大量活性氧簇(ROS)產生。體外研究表明H2O2可以通過激活Cbfα1促進VSMC由收縮型向成骨型轉化〔12〕?？寡趸饔玫母呙芏戎鞍准唉?3多不飽和脂肪酸有抑制血管鈣化的作用〔13，14〕。氧化低密度脂蛋白能促進β-甘油磷酸鹽誘導的VSMC成骨樣轉化〔15〕。血管鈣化，礦物質基質的形成又可作用于單核細胞促進炎癥因子的釋放〔16〕。

高血糖、血脂是AS發(fā)生的危險因素，同時也是硬化斑塊鈣化的危險因素。糖尿病患者發(fā)生CAC比非糖尿病患者顯著增加〔17〕。高糖在體外可以通過增加VSMC中Cbfα1轉錄因子的表達，呈時間依賴性促進VSMC的成骨性轉化〔18〕。一項6 093例個體的研究表明高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)與CAC有很好的相關性，要高于低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)〔19〕。Orakzai等〔20〕對非高密度脂蛋白(Non-HDL-C)即包含致冠狀動脈硬化載脂蛋白B的所有顆粒(極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、乳糜顆粒、脂蛋白a等)和LDL-C、HDL-C、甘油三酯進行比較，認為Non-HDL-C和CAC相關性最強。研究表明血清膽紅素水平〔21〕及游離甲狀腺素水平〔22〕和CAC呈負相關，其水平降低是AS斑塊鈣化新的危險因素。

3 AS斑塊鈣化相關因子

RANKL/OPG參與AS斑塊鈣化的研究較多。RANKL也稱為腫瘤壞死因子超家族成員(TNFSF)11，是前體破骨細胞分化、成熟的啟動因子，其主要生理功能之一是促進破骨細胞分化，刺激破骨細胞活化。在不穩(wěn)定動脈粥樣斑塊中存在RANKL的表達，來源于轉化的VSMC和內皮細胞，這對于斑塊中破骨細胞的生成和功能有重要作用〔23〕。RANKL可以和其跨膜受體RANK結合，通過細胞內信號轉導激活MAPK，NF-κB，調節(jié)多種細胞活性。這些細胞主要是單核細胞來源的破骨細胞前體細胞、T細胞、B細胞和樹突細胞〔24〕。RANKL的促破骨細胞作用使其表現(xiàn)為抗鈣化因子，能夠降低動脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定性。然而Sandberg等〔25〕的研究表明RANKL可以增加單核細胞趨化因子(MCP)-1及基質金屬蛋白酶(MMP)的表達從而誘導斑塊的不穩(wěn)定性。因此RANKL在AS的確切機制有待研究。

OPG是破骨細胞生成抑制因子，在骨代謝調節(jié)中起關鍵性作用，可與RANKL高度親和而阻礙RANKL同RANK的結合。OPG基因敲除小鼠有嚴重的骨質疏松，同時2/3的小鼠腎動脈及主動脈中膜發(fā)生鈣化〔26〕。OPG能抑制維生素D誘導血管鈣化小鼠模型的動脈鈣化，而血清中鈣磷濃度沒有發(fā)生變化，表明OPG對血管鈣化的抑制作用不是通過降低血鈣或血磷水平達到的〔27〕。OPG也可抑制載脂蛋白(Apo)E基因缺陷小鼠動脈粥樣硬化斑塊的鈣化〔28〕，表明OPG能夠抑制鈣化，具有保護作用。Dhore等〔29〕對尸解標本的研究發(fā)現(xiàn)，在血管骨樣組織鈣沉積周圍的細胞基質中可以檢測到OPG/RANKL，進一步證實OPG/RANKL系統(tǒng)參與 AS和鈣化的過程。Jono等〔30〕檢測了201例行冠狀動脈造影患者的血清OPG水平，研究結果顯示冠狀動脈狹窄的患者血清OPG水平明顯高于無冠狀動脈狹窄者，且隨著冠脈病變支數及嚴重程度增加。Mohammadpour等〔31〕的研究表明血清OPG/RANKL比值和CAC顯著相關，血清OPG/RANKL有可能成為新的預測心血管事件發(fā)生的指標。

OPN、胎球蛋白-A(FA)、人基質γ羧基谷氨酸蛋白(MGP)及瘦素(LP)是除OPG/RANKL系統(tǒng)外和斑塊鈣化有關且在血中可檢測到的蛋白因子。OPN在正常動脈不表達而在鈣化的動脈粥樣斑塊處高表達〔32〕。OPN抑制羥磷灰石的生長，增加其在酸性環(huán)境的分解〔33〕。體外實驗證明OPN敲除小鼠VSMC更易產生鈣化，表明OPN有抑制鈣化的血管保護作用〔34〕。Uz等〔35〕認為血清OPN水平可以評價可疑冠心病人冠狀動脈鈣化程度。Minoretti等〔36〕的研究表明血清OPN水平可以預測穩(wěn)定心絞痛患者不良心血管事件的發(fā)生，具有危險分層的價值。Georgiadou等〔37〕進一步證明血清OPN水平在缺血性心臟疾病有很好預測價值。

FA在肝臟表達后進入血液循環(huán)，主要聚集在骨骼。FA的N端富含酸性氨基酸殘基，與堿性磷酸鈣結合形成可溶性無定形膠體微球，從而增加其溶解度，抑制血清過飽和的鈣磷鹽沉積。研究表明VSMC攝取FA后其鈣化能力降低〔38〕。在血液透析患者，低血清FA水平和CAC相關〔39〕。但另一項研究認為血清FA水平和CAC無關〔35〕。

MGP能夠直接抑制血管壁礦物質的沉積，也可通過抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2和BMP-4的活性抑制VSMC的成骨性轉化〔40，41〕。MGP抑制血管鈣化的活性依賴于其谷氨酸殘基的羧基化，而維生素 K是催化這一反應的必需輔助因子〔42〕。MGP敲除小鼠動脈自發(fā)發(fā)生鈣化，其平滑肌細胞失去一些收縮型標志物，而Cbfa1、OPN及骨鈣素和這些成骨相關的蛋白表達增加〔43〕。一項臨床實驗表明對于可疑冠心病患者，血清MGP水平和CAC呈負相關〔44〕。但另一項研究卻表明血清MGP水平和AS的危險因素相關，而和動脈鈣化無關〔45〕。

LP是一種脂肪組織分泌的肽類激素，進入血液循環(huán)后作用于LP受體，參與糖、脂肪及能量代謝的調節(jié)。LP有增加血管內皮細胞氧自由基生成，促進泡沫細胞形成，誘導內皮細胞增生，MMP表達等多種生物學效應。促進AS發(fā)生發(fā)展〔46，47〕。體外研究表明LP可通過抑制糖原合成酶(GSK)-3β的活性，呈劑量依賴增加VSMC的成骨性轉化〔48〕。在ApoE敲除小鼠動物模型，給予腹腔注射LP能夠促進AS斑塊鈣化的發(fā)生〔49〕。對無臨床癥狀患者及2型糖尿病患者的研究表明血清LP水平獨立于傳統(tǒng)風險因素和 CAC 相關〔50，51〕。Iribarren 等〔52〕的研究表明血清LP水平和年老女性患者的CAC相關，但該作用不是獨立的，和血脂、血壓、胰島素抵抗等其他因素相關。

關于血清炎癥相關因子作為斑塊鈣化的指標有爭議。Hamirani等〔53〕總結了12篇有關血清炎癥因子和CAC的文章，測定的炎癥因子包括C反應蛋白(CRP)、MMP-9、纖維蛋白原、MCP-1、人抵抗素、脂蛋白相關磷脂酶A2(Lp-PLA2)、白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α及成纖維細胞生長因子(bFGF)，發(fā)現(xiàn)炎癥因子與斑塊鈣化的關系是微弱的，建議有計劃的大規(guī)模研究。Jenny等〔54〕對6 783例不同種族亞臨床癥狀患者的血IL-6，CRP，纖維蛋白原進行研究，發(fā)現(xiàn)三者和CAC都有一定相關性，但在排除冠心病風險因素后，只有IL-6和CAC相關。最近，一項對455例個體20種炎性因子的研究表明，IL-6、IL-8和 IL-13與 CAC明顯相關，而 CRP缺少聯(lián)系〔55〕。Li等〔56〕認為CAC和炎癥因子CRP的升高可能有著不同的病理生理機制，是兩者缺少相關性的原因。血清炎癥因子的改變和AS斑塊鈣化均與心血管事件的發(fā)生密切相關。

4 microRNA參與VSMC成骨性轉化

microRNAs(miRNAs)是一種小的內源性非編碼RNA分子，大約由21～25個核苷酸組成。這些小的miRNA通常靶向一個或者多個mRNA，在翻譯水平抑制或斷裂靶mRNAs調節(jié)基因的表達，參與細胞增殖、分化、遷移和調亡。已發(fā)現(xiàn)microRNAs和多種疾病相關。AS斑塊鈣化由多種蛋白因子參與調節(jié)，和蛋白表達密切相關的microRNAs必然發(fā)揮重要作用。已發(fā)現(xiàn)microRNAs參與VSMC的表型轉化。

miR-204在心肌及 VSMC中表達。Cui等〔57〕培養(yǎng)小鼠VSMC細胞發(fā)現(xiàn)miR-204在β-甘油磷酸鹽誘導的VSMC鈣化過程中顯著下降，認為miR-204與鈣化發(fā)生相關。堿性磷酸酶(ALP)是破骨細胞分化前期的標志，骨鈣素是成骨細胞分化中期既骨基質形成階段的標志。抑制miR-204能夠增加VSMC的ALP、骨鈣素及Runx2的表達。相反，過表達miR-204能抑制VSMC的鈣化。Runx2是成骨細胞分化重要轉錄因子。進一步研究證明miR-204是通過下調Runx2抑制VSMC鈣化。miR-125b是除miR-145、miR-23、miR-143外在動脈表達豐富的microRNA之一。培養(yǎng)人冠狀動脈VSMC在成骨性轉化過程中miR-125b的表達明顯下降，抑制內源性miR-125b可以增加VSMC ALP的表達及基質的礦物質化。在體內，ApoE敲除誘導的小鼠動脈鈣化模型中，miR-125b含量顯著下降。miR-125b參與了VSMC的成骨性轉化，該作用可能是通過SP7轉錄因子實現(xiàn)的〔58〕。最近 Gui等〔59〕應用血管鈣化動物模型篩選出miR-135a、miR-762、miR-714和 miR-712為差異表達 microRNAs，并在體外培養(yǎng)VSMC中進行證實。這些microRNA的作用靶點為NCX1、PMCA1和 NCKX4，它們均為和Ca離子通道相關蛋白。miR-135a、miR-762、miR-714和 miR-712與 Ca及 Pi誘導的VSMC成骨性轉變相關。

AS斑塊鈣化的發(fā)生是多種蛋白因子及microRNAs相互作用的結果，對其發(fā)病機制的了解，有利于尋找血清標志物幫助臨床診斷及危險分層，并為靶向藥物治療提供線索，對于降低急性心血管事件的發(fā)生非常重要。

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