魏山坡　李翀瑤　司道文

(保定市兒童醫(yī)院,河北　保定　071000)

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孕酮對(duì)大鼠腦損傷后腦水腫的影響及機(jī)制

魏山坡李翀瑤1司道文1

(保定市兒童醫(yī)院,河北保定071000)

摘要〔〕目的觀察孕酮對(duì)大鼠腦損傷(TBI)后腦水腫和前列腺素(PGE2)表達(dá)的影響。方法雄性老年SD大鼠48只隨機(jī)分為假手術(shù)組、TBI組和孕酮治療組，按照改良的Feeney自由落體損傷裝置制作大鼠腦損傷模型。孕酮治療組傷后1、6 h腹腔注射孕酮16 mg/kg。各組于傷后24 h取材。用免疫組織化學(xué)法和免疫印跡法觀察大鼠皮質(zhì)PGE2的表達(dá)水平變化，并測(cè)量腦組織含水量。結(jié)果與假手術(shù)組大鼠相比，TBI組大鼠皮質(zhì)PGE2表達(dá)和腦水腫較假手術(shù)組顯著增加(P<0.05)；孕酮治療組與TBI組比較，大鼠皮質(zhì)PGE2表達(dá)和腦水腫明顯減少(P<0.05)。結(jié)論孕酮可能通過(guò)降低PGE2的表達(dá)進(jìn)而降低腦水腫，發(fā)揮TBI保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕孕酮；腦損傷；腦水腫；前列腺素

1華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

第一作者：魏山坡(1977-),男,碩士，副主任醫(yī)師，主要從事外科學(xué)研究。

腦損傷(TBI)目前尚無(wú)有效的治療藥物。近年發(fā)現(xiàn)孕酮(PROG)是一種非常具有潛力的腦保護(hù)藥物，在不同的模型和種屬以及不同的實(shí)驗(yàn)室，均得到了孕酮對(duì)腦損傷安全性和有效性的證據(jù)，其潛在治療價(jià)值越來(lái)越受到認(rèn)可〔1～7〕。兩項(xiàng)Ⅱ期隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)表明，孕酮用于治療臨床患者TBI可明顯減少死亡率〔8,9〕。根據(jù)前期研究結(jié)果，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院贊助的孕酮治療腦外傷的Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)(ProTECTⅢ:NCT00822900)正在進(jìn)行，包括17個(gè)神經(jīng)外科中心和預(yù)期1 000例患者，期待這些大樣本多中心臨床對(duì)照試驗(yàn)，在不久的將來(lái)能對(duì)孕酮治療顱腦創(chuàng)傷的療效及安全性作出科學(xué)評(píng)價(jià)〔10〕。目前對(duì)孕酮降低腦水腫的機(jī)制尚不明確。由于炎癥反應(yīng)在TBI后的繼發(fā)性損傷中占有重要作用，是引起腦水腫的重要因素；而且炎癥反應(yīng)中環(huán)氧化酶(COX)-2的代謝產(chǎn)物前列腺素(PGE2)是重要的炎癥因子。因此，本實(shí)驗(yàn)擬建立老年大鼠TBI模型，探討孕酮降低腦水腫的機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料健康雄性20月齡SD大鼠48只，體質(zhì)量300 g(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、TBI組和孕酮治療組，每組16只，分別用于PGE2免疫組織化學(xué)檢測(cè)和腦水腫測(cè)定。孕酮注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，兔抗人PGE2多克隆抗體(美國(guó)Cayman公司)，免疫組織化學(xué)試劑盒 (福州邁新生物)。

1.2動(dòng)物模型采用Feeney自由落體硬腦膜外撞擊方法建立模型。大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，在矢狀縫后1.5 mm，中線旁2.5 mm處打開(kāi)一直徑5 mm骨窗，用40 g的擊錘從25 cm處自由墜落沖擊撞桿造成腦損傷。假手術(shù)組僅切開(kāi)頭皮，開(kāi)同樣大小骨窗而不造成腦挫傷。孕酮治療組傷后1、6 h腹腔注射孕酮16 mg/kg。假手術(shù)組和TBI組在相同時(shí)相腹腔注射等量生理鹽水。

1.3腦組織含水量測(cè)定大鼠24 h斷頭后快速剝離全腦，距傷灶周?chē)? mm處取出腦組織，精密電子分析天平測(cè)其濕重，然后放入110℃烤箱烘烤24 h，取出后冷卻10 min后稱(chēng)干重，按下面公式計(jì)算：腦含水量(%) =(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)于傷后24 h，對(duì)大鼠腦組織取材固定，自視交叉后用恒冷箱切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，片厚10 μm，貼附于載玻片上待用。免疫組化檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。PBS代替一抗作陰性對(duì)照。陽(yáng)性細(xì)胞為胞質(zhì)和突起呈棕黃色。采用CMIAS真彩色醫(yī)學(xué)圖像免疫組化自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。切片在400倍光鏡下觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以平均值代表各區(qū)計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.5Western 印跡檢測(cè)傷后24 h，大鼠麻醉后取腦，分離傷灶周?chē)樱萌爰?xì)胞裂解液中，低溫勻漿，離心15 min，取上清。蛋白定量后加入4倍體積樣本緩沖液，95℃變性5 min。取20 μg樣品在100 g/L SDS-PAGE上電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker為參照，加入兔抗人PGE2 mAb (1∶400)，4℃過(guò)夜，TBST沖洗后，加入二抗，DAB顯色。以β-actin作為內(nèi)參。蛋白條帶掃描后，應(yīng)用CMIAS真彩醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶平均光密度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件行方差分析，兩變量間關(guān)系分析采用線性相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1孕酮對(duì)大鼠TBI后腦水腫的影響與假手術(shù)組大鼠腦組織含水量〔(74.2±1.62)%〕比較，TBI組腦組織含水量明顯增多(83.4±2.48)%(P<0.05)。孕酮治療組腦組織含水量較TBI組顯著減少〔(78.5±2.19)%,P<0.05〕。

2.2孕酮對(duì)大鼠TBI后皮層PGE2表達(dá)的影響免疫組化顯示，假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)偶見(jiàn)PGE2表達(dá)(3.4±0.28)%。TBI組傷灶周?chē)べ|(zhì)可見(jiàn)大量PGE2陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)〔(46.2±2.76)%，P<0.05〕。孕酮治療組腦損傷周?chē)べ|(zhì)PGE2陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少(31.5±2.17)%(P<0.05)。進(jìn)一步Western印跡檢測(cè)顯示，假手術(shù)組有少量PGE2蛋白表達(dá)(2.1±0.19)%。孕酮治療組PGE2條帶光密度值〔(12.8±1.86)%〕與TBI組〔(24.3±2.14)%〕比較，蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。同時(shí)TBI后腦組織含水量與PGE2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.725,P<0.05)。

3討論

TBI嚴(yán)重危害人類(lèi)健康〔11〕，TBI后炎癥反應(yīng)在繼發(fā)性損傷中具有重要作用。TBI后，通過(guò)膠質(zhì)細(xì)胞增生，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，激活釋放細(xì)胞介質(zhì)和炎性因子，從而誘發(fā)和加重血管源性和細(xì)胞毒性腦水腫。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)孕酮可以抑制TBI后炎性因子TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)過(guò)程〔12,13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TBI后腦水腫的形成可能與PGE2有關(guān)；孕酮干預(yù)后，可明顯減低腦組織含水量和PGE2，表明孕酮可能通過(guò)抑制PGE2的表達(dá)進(jìn)而降低腦水腫，發(fā)揮腦保護(hù)作用。孕酮通過(guò)減輕腦水腫、保護(hù)血腦屏障、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、減少自由基的產(chǎn)生、減輕鈣超載、抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、抑制炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)作用，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔3〕。許多治療腦外傷的藥物在臨床試驗(yàn)中被否定，或許因?yàn)檫@些藥物僅作用TBI后的單一病理因素，因此不能獲得良好的治療功效；而孕酮能夠阻止創(chuàng)傷后不同階段的病理改變，保護(hù)神經(jīng)元功能和促進(jìn)DNA修復(fù)，具有多效性。而且，孕酮在腦內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元均可合成孕酮，孕酮還能保護(hù)發(fā)育的胎兒免遭氧化應(yīng)激和免疫炎癥的侵害，在神經(jīng)元-膠質(zhì)通訊和正常神經(jīng)元發(fā)育中起關(guān)鍵性作用；因此可以設(shè)想孕酮在成人中樞神經(jīng)元損傷修復(fù)中，許多過(guò)程實(shí)際重復(fù)了胚胎發(fā)育的關(guān)鍵步驟，這也從另一個(gè)角度提示孕酮具有腦保護(hù)作用〔1〕。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了孕酮的腦保護(hù)功能。另外，孕酮有較寬的治療窗，能夠迅速通過(guò)血腦屏障，具有使用方便、安全、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，使得孕酮在治療TBI方面逐漸被認(rèn)同，有可能成為非常具有潛力的治療TBI的藥物。

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〔2014-05-19修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

通訊作者：司道文(1975-),男,碩士，副教授，主要從事人體解剖學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：河北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(Z2011168);唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(12140209A-55)；華北理工大學(xué)學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(X2015139)

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R742.7〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)21-6017-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.006