李天芝，于新友，沈志強(qiáng)，2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

豬圓環(huán)病毒分子生物學(xué)診斷技術(shù)及基因工程疫苗的研究進(jìn)展

李天芝1，于新友1，沈志強(qiáng)1，2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

文章論述了豬圓環(huán)病毒分子生物學(xué)診斷方法，包括常規(guī)PCR 方法、套式PCR方法、多重PCR方法、PCRRFLP方法、熒光定量PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等，并就其基因工程疫苗方面的研究進(jìn)行了著重闡述。

豬圓環(huán)病毒；分子生物學(xué)診斷；基因工程疫苗

豬圓環(huán)病毒(PCV)是圓環(huán)病毒科、動(dòng)物圓環(huán)病毒屬的成員。PCV可以分為PCV1和PCV2兩種血清型。PCV1無(wú)致病性。PCV2具有致病性，該病主要以進(jìn)行性消瘦和多系統(tǒng)病理?yè)p傷為特征，可引起斷奶豬和育肥豬生長(zhǎng)緩慢、呼吸急迫、消瘦、貧血、出現(xiàn)黃疸現(xiàn)象，剖檢后發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)腫大、肝硬變、多灶性黏液性氣管炎、間質(zhì)性肺炎和腎炎，給養(yǎng)豬業(yè)造相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。1991年，在加拿大首次暴發(fā)該病，隨后，世界各國(guó)家和地區(qū)都有該病的報(bào)道，并在患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)等病豬體內(nèi)分離到PCV2，并證明PCV2與這些嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的疾病密切相關(guān)。目前該病毒引起了國(guó)內(nèi)外獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注。

1 分子生物學(xué)診斷

1.1 常規(guī)PCR 方法

PCR方法是根據(jù)目的片段設(shè)計(jì)引物，借助儀器和DNA聚合酶體外大量擴(kuò)增部分或全部目的片段，是一種快速、簡(jiǎn)便、特異的診斷方法。蔣成硯等根據(jù)GenBank中PCV2的序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，用PCR方法擴(kuò)增豬PCV2基因保守區(qū)序列，并對(duì)PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：該法具有快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，可用于PCV2的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查等，178份臨床病料中有83份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為46.6%。李英等采用針對(duì)PCV2 ORF2設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)某豬場(chǎng)出現(xiàn)的PMWS典型癥狀的病豬進(jìn)行PCR檢測(cè)，從病豬的組織樣品中檢測(cè)PCV2，從10頭發(fā)病豬的組織樣品中檢測(cè)PCV2，結(jié)果有7頭呈陽(yáng)性結(jié)果。

1.2 套式PCR方法

套式PCR方法是設(shè)計(jì)內(nèi)外2種引物，同時(shí)擴(kuò)增2次，該法能節(jié)省模板，且敏感性較高。王貴平等根據(jù)GenBank登錄PCV2基因全序列，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立了PCV2的套式PCR檢測(cè)方法，對(duì)該方法用序列分析、酶切等方法進(jìn)行了鑒定，同時(shí)用該套式PCR方法對(duì)華南地區(qū)287個(gè)豬場(chǎng)的1 560份樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果，983份為PCV2陽(yáng)性，陽(yáng)性率為63%。趙浩軍等根據(jù)Genbank中發(fā)表的PCV2全基因序列，設(shè)計(jì)2對(duì)PCV2特異性引物，建立套式PCR檢測(cè)方法。外測(cè)引物p1、p2擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為647 bp，內(nèi)測(cè)引物p3、p4擴(kuò)增長(zhǎng)度為219 bp。其中用外部引物可擴(kuò)增DNA含量到10-5mg/mL，并且套式PCR比普通PCR靈敏性還要提高103倍。

1.3 多重PCR方法

多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，它在同一PCR體系中，加入多對(duì)引物，同時(shí)檢測(cè)2種或2種以上的病毒DNA，它具有快速、靈敏度高、高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而廣泛用于臨床的快速診斷。王隆柏等建立豬群常見(jiàn)CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PPV的5種疾病的的多重PCR診斷方法，該法特異性好，對(duì)SIV、JEV、SS2、PEDV核酸的檢測(cè)結(jié)果為陰性，能檢測(cè)到的CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PPV核酸濃度分別為220、1.6、72、400和370pg。付朋飛等根據(jù)PBoV PCV2基因序列，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)PBoV和PCV2的雙重PCR方法。該方法可以同時(shí)擴(kuò)增出PBoV的209bp和PCV2的476bp特異性片段，而對(duì)偽PRV、PPV、沙門(mén)氏菌、大腸埃希氏菌DNA模板擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，對(duì)PBoV和PCV2的最低檢出量均為100拷貝/μL。單重PCR與雙重PCR檢測(cè)符合率為100%。

1.4 PCR-RFLP方法

PCR-RFLP方法通過(guò)設(shè)計(jì)保守引物，PCR擴(kuò)增目的基因序列片段，然后用限制性內(nèi)切酶酶切，通過(guò)觀察其酶切片段差異即可鑒定不同種或不同基因型。Fenaux等先以PCR快速而有效地?cái)U(kuò)增微量的豬圓環(huán)病毒DNA，然后再利用RFLP區(qū)分PCV1和PCV2，以此來(lái)進(jìn)行豬圓環(huán)病毒的檢測(cè)和定型，他們根據(jù)PCV1和PCV2的243 bp片段，利用僅在PCV2上有的限制性酶切片段位點(diǎn)NcoI來(lái)鑒定PCV1和PCV2。PCV2的PCR產(chǎn)物可被NcoI切成168bp和750 bp的兩個(gè)片段，而在PCV1的PCR產(chǎn)物上則無(wú)NcoI的位點(diǎn)，所以不能被NcoI切割，這樣就可以直接區(qū)分PCV1和PCV2了。王新等用PCR-RFLP方法，對(duì)PK-15細(xì)胞，IBRS-2細(xì)胞以及疑似PMWS、豬皮炎與腎病綜合征的病變組織進(jìn)行了PCV2檢測(cè)以及血清型的鑒定，結(jié)果顯示，IBRS-2細(xì)胞和1份PMWS病變組織中檢測(cè)出PCV1基因片段，1份PMWS病變組織和1份PDNS病變組織檢測(cè)出PCV2基因片段。

1.5 熒光定量PCR方法

熒光定量PCR技術(shù)是指采用SYBR GreenⅠ熒光染料或熒光探針通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，不需要分離PCR產(chǎn)物，即能準(zhǔn)確定量起始模板數(shù)。董林等建立了檢測(cè)PCV2的特異性熒光定量PCR方法，該法Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品模板在3.21×100～4.16×108拷貝/μL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9988，斜率為-3.286。該方法與PCV1、PRV、PRRSV、PPV、CSFV、大腸桿菌基因組均無(wú)交叉反應(yīng)，敏感性為3.21×100拷貝/μL，比常規(guī)PCR高1 000倍，批間和皮內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于3.00%。對(duì)臨床采集PCV2疑似陽(yáng)性病料檢測(cè)結(jié)果表明，所建立的熒光定量PCR陽(yáng)性檢測(cè)率為58.94%，顯著高于普通PCR檢測(cè)率。李鵬等根據(jù)PCV2 ORF1設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，建立了SYBRGreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法，該法靈敏度可達(dá)10-100拷貝/μL，比常規(guī)PCR檢測(cè)方法靈敏度高10倍，而與PRRSV、PRV、CSFV、和PPV沒(méi)有交叉反應(yīng)，與常規(guī)PCR相比，該法具有較高的靈敏度和特異性。

1.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是在等溫條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)?；虻臄U(kuò)增和產(chǎn)物的檢測(cè)可一步完成，擴(kuò)增效率和特異性高，可在15～60 min擴(kuò)增109～1010倍，可只通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的有、無(wú)來(lái)判別。申世川等建立了基于ORF2基因的PCV2 LAMP檢測(cè)方法，在BstDNA聚合酶的作用下對(duì)靶序列進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增。所建立方法在61 ℃反應(yīng)1 h能夠成功的檢測(cè)出PCV2基因組DNA，結(jié)果可經(jīng)電泳檢測(cè)及肉眼觀察；敏感性和特異性試驗(yàn)表明，檢測(cè)敏感度可以達(dá)到0.5 pg的DNA分子，所建立LAMP方法的陽(yáng)性檢出率與國(guó)標(biāo)PCR的陽(yáng)性檢出率符合度為100%。楊澤曉等建立了快速檢測(cè)PCV2的LAMP方法，在64 ℃45 min條件下可擴(kuò)增出大于1 345 bp的特異性梯狀DNA條帶，檢測(cè)限度可達(dá)10 copies/μL，用它對(duì)PCV1、PPV、PRV、PRRSV和CSFV的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，但結(jié)果均為陰性。

2 基因工程疫苗

2.1 亞單位疫苗

只含有病原微生物的抗菌抗原成分，而不含有核酸，但能刺激機(jī)體產(chǎn)生特應(yīng)性免疫應(yīng)答的一類(lèi)疫苗，稱(chēng)為亞單位疫苗。付玉潔等為評(píng)價(jià)豬圓環(huán)病毒(PCV)2a/2b兩種基因型病毒株及其重組Cap蛋白(rCap)之間的交互免疫，采用重組桿狀病毒表達(dá)的2種Cap蛋白(PCV2a-rCap和PCV2b-rCap)亞單位疫苗。免疫小鼠后進(jìn)行攻毒，結(jié)果，以PCV2a和PCV2b各為指示病毒對(duì)病毒抗血清和rCap蛋白抗血清進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，同型病毒株與同型血清的中和抗體效價(jià)均高于異型病毒株。病理觀察顯示，免疫鼠均未見(jiàn)明顯病理變化，攻毒對(duì)照鼠肺臟出現(xiàn)一定程度的病理?yè)p傷。劉丹等以重組桿狀病毒表達(dá)的重組PCV2-Cap蛋白制備亞單位疫苗，免疫BALB/c鼠測(cè)定其抗體、中和抗體。結(jié)果表明，該蛋白亞單位疫苗能夠提供良好的免疫保護(hù)效果，能夠有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的體液免疫應(yīng)答。

2.2 核酸疫苗

構(gòu)建含有外源抗原基因的重組質(zhì)粒，免疫動(dòng)物后，表達(dá)的特異性抗原蛋白通過(guò)與MHC-Ⅰ類(lèi)或MHC-Ⅱ類(lèi)抗原分子結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，該類(lèi)疫苗稱(chēng)為核酸疫苗，又名DNA疫苗。史小紅等將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNAORF1-ORF2免疫小鼠，2周后加強(qiáng)免疫，同時(shí)設(shè)置pcDNA-ORF1、pcDNAORF2、pcDNA3.1-(+)、PCV2全毒疫苗和PBS對(duì)照。結(jié)果表明，該重組質(zhì)粒誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2抗體水平與其他試驗(yàn)組相比差異顯著。閆若潛等將豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）ORF2/豬白介素-2(PoIL-2)嵌合重組表達(dá)質(zhì)粒(rpcDNA3.1/PCV2-1inker-PoIL-2)免疫10日齡健康仔豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒對(duì)豬體的免疫和免疫保護(hù)效果顯著。

2.3 活載體疫苗

采用弱毒或無(wú)毒病原微生物作為表達(dá)載體，對(duì)其導(dǎo)入外源抗原基因，制成疫苗后，接種動(dòng)物，誘導(dǎo)機(jī)休產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，這類(lèi)新型疫苗稱(chēng)為活載體疫苗。宮婷等構(gòu)建了表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白重組復(fù)制缺陷型人5型腺病毒，對(duì)重組腺病毒的分子生物學(xué)鑒定和在小鼠上的初步免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，重組腺病毒可介導(dǎo)Cap蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)，并且表達(dá)的靶蛋白具有較好的免疫原性，為進(jìn)一步將其開(kāi)發(fā)成新型PCV2疫苗奠定了基礎(chǔ)。王子龍等利用NDV LaSota弱毒疫苗株為活病毒載體，通過(guò)反向遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建出表達(dá)PCV2Cap的重組病毒(rLa-PCV2/ Cap)，以及表達(dá)刪除核定位信號(hào)(NLS)的Cap(CapΔ41)的重組病毒(rLa-PCV2/CapΔ41)，并對(duì)外源蛋白的表達(dá)效果進(jìn)行了檢測(cè)，為研究新型PCV2疫苗奠定基礎(chǔ)。鈔安軍等將PCV2ORF2基因插入到PRV通用載體pG中，成功構(gòu)建了重組病毒PGO，并用該重組病毒免疫6周齡雄性小鼠并檢測(cè)分析了PGO的免疫原性，結(jié)果表明，該重組病毒能有效抵抗PCV2強(qiáng)毒攻擊。

3 前景展望

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，目前已經(jīng)建立了PCV2多種分子生物學(xué)檢測(cè)方法，這些檢測(cè)方法各有利弊，如常規(guī)PCR方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、檢出率高等特點(diǎn)，但不能準(zhǔn)確的定量、容易污染，且敏感性有限。熒光定量PCR儀器和探針的合成價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本比較高，LAMP方法靈敏度高導(dǎo)致假陽(yáng)性。最好幾種檢測(cè)方法結(jié)合起來(lái)，綜合判斷，才能使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。近年來(lái)，PCV2新型疫苗研制，已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但由于種種原因近停留在實(shí)驗(yàn)室階段，并沒(méi)有大規(guī)模推廣應(yīng)用實(shí)際生產(chǎn)中，相信在不久的將來(lái)著病毒分子生物學(xué)的發(fā)展及對(duì)豬圓環(huán)病毒蛋白功能本質(zhì)研究的深入，必將研制出安全、高效、廉價(jià)、易于保存和運(yùn)輸?shù)男滦突蚬こ桃呙纭?/p>

略。

2015-06-13）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-06-011-14)，山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2013CQ006)

李天芝(1985-)，女，漢族，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病研究。