基因工程在骨髓間充質干細胞治療心肌梗死中的應用

王曼李樹仁

(河北醫(yī)科大學附屬河北省人民醫(yī)院，河北石家莊050051)

關鍵詞〔〕基因工程；充質干細胞；心肌梗死

中圖分類號〔〕R54〔

通訊作者：李樹仁(1964-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事冠心病介入及心力衰竭研究。

第一作者：王曼(1987-)，女，在讀碩士，主要從事心血管病學研究。

隨著溶栓和急診冠脈介入的廣泛開展，急性心肌梗死(AMI)的死亡率明顯降低。但是心肌梗死后心室重構以及缺血性心肌病的發(fā)生嚴重影響了患者的預后。要使心肌細胞再生乃至衰竭的心臟恢復功能仍是一項巨大的挑戰(zhàn)。研究提示骨髓間充質干細胞(BMSCs)可參與受損心肌的重建，可以提高左室射血分數(shù)，降低左心室收縮末期和舒張末期容積、減少梗死面積并改善左室重構〔1〕。但是BMSCs在梗死心肌中的長期存活仍未能解決。心肌梗死后微環(huán)境的改變限制了干細胞的修復能力，人們正在利用BMSCs基因工程的方法來解決這一問題?；蚬こ淌菍⑼庠葱曰驅肽康募毎校沟迷摷毎邆溥^表達或靜默表達某種基因的能力。本文闡述基因工程在骨髓間充質干細胞治療心肌梗死中的應用。

1基因導入系統(tǒng)

基因導入系統(tǒng)是基因治療的核心技術，有物理、化學、生物三類方法，可分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)，按基因表達時限可分為瞬時表達系統(tǒng)和永久表達系統(tǒng)。應根據(jù)需要借助不同的方法。物理法包括電穿孔法、基因槍粒子轟擊法和顯微注射法等。物理法雖操作簡便，但效率低?；瘜W法包括磷酸鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、陽離子脂質體法、陽離子多聚物(多聚賴氨酸，聚乙烯亞胺，樹突狀聚合物)、殼聚糖載體聚合物和無機納米粒子載體等。生物法主要指病毒載體，包括腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體和慢病毒載體等。

2MSCs治療心肌梗死的機制

MSCs存在于多種成體組織內(nèi)，骨髓是MSCs的主要來源。MSCs可分化為包括骨、軟骨、肌肉、脂肪、肝臟、腎臟、內(nèi)皮、神經(jīng)元、心肌等在內(nèi)的多個細胞譜系。自體和異體的MSC都被證明能夠參與組織再生。MSCs移植改善梗死后心臟功能的機制主要包括以下兩點：①MSCs可分泌多種因子，促進細胞增殖與血管再生建立側支循環(huán)，抑制梗死區(qū)擴大與心肌細胞凋亡〔2〕；②MSCs能表達肌鈣蛋白-1和connexin-43分子等心臟特異性標記物，能夠分化成為心肌細胞，并與宿主心肌細胞形成耦聯(lián)，參與宿主心臟的同步收縮。目前更傾向于MSCs的分泌功能。MSCs通過旁分泌和自分泌途徑分泌大量的功能性細胞因子，包含有局部的免疫抑制、對纖維化過程的抑制以及對血管生成的支持作用等。

3修飾BMSCs的基因

BMSCs易于被外源基因轉染并穩(wěn)定表達，對其進行基因修飾可以使BMSCs具有更好的促血管再生、抗細胞凋亡、抗炎、修復心功能的作用。

3.1細胞因子相關基因單純細胞移植有一定的局限性，為此將細胞移植與基因治療聯(lián)合起來。關于細胞因子的基因研究最多，通過細胞因子修飾的BMSCs可抬高細胞移植后的存活，改善細胞生存環(huán)境，在心肌梗死后心功能改善方面有廣泛的應用。

血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF) 是目前發(fā)現(xiàn)的促血管生成作用的因子之一，將低氧環(huán)境誘導下經(jīng)VEGF修飾的MSCs進行移植，與未修飾組比，VEGF表達進一步增加，促進血管增生，明顯減小大鼠心肌梗死面積，增強BMSCs對梗死微環(huán)境的耐受，利于移植細胞存活，促進組織修復，但對心功能改善不明顯〔3〕。血管生長素-1(Ang-1)也是一個促進血管生成的因子，用腺病毒將Ang-1基因導入BMSCs，將替代治療和血管生成結合起來，促進血管生長，延緩心肌重塑，提高心功能〔4〕。

肝細胞生長因子(HGF)是具有調節(jié)細胞生長和運動及誘發(fā)血管生成的多功能細胞因子，也是一種特異的促內(nèi)皮細胞生長因子，具有抑制細胞凋亡與組織重構、修復內(nèi)皮損傷促血管內(nèi)皮細胞分裂作用。用逆轉錄病毒載體對移植前的BMSCs進行預處理，使BMSCs過表達HGF，使移植的BMSCs在心肌梗死區(qū)HGF表達增加，改善局部微環(huán)境，減輕炎癥反應，利于移植細胞存活，其機制與促進旁分泌機制有關。同時發(fā)現(xiàn)心肌梗死后2 w心肌注射BMSCs最有利〔5〕。

堿性成纖維細胞生長因子(bFGF或FGF)-2是成纖維細胞生長因子家族的基本成員，具有促細胞分裂，促進血管形成，參與損傷修復等多種生物學活性，對BMSCs進行該基因修飾可激活細胞分裂素(絲裂原)活化蛋白激酶及蛋白激酶C，調高BCL-2的表達，提高BMSCs的移植存活率，促進間充質干細胞分化為心肌樣細胞，促進梗死區(qū)毛細血管新生，減小心肌梗死面積改善心功能〔6〕。

胰島素樣生長因子(IGF)-1在細胞的分化、增殖、個體的生長發(fā)育中具有重要的促進作用。有學者將IGF-1導入BMSC中使BMSCs更耐受缺氧環(huán)境，移植成活率高，促進毛細血管生長，減小梗死面積，抑制心肌增厚，激活PI3K/Akt信號途徑，減少細胞凋亡，通過基質衍生因子1α/趨化因子受體4軸(SDF-1α/CXCR4)促進細胞向梗死部位遷移〔7〕。也有學者采用逆轉錄病毒使BMSCs過表達CXCR4的方法，經(jīng)靜脈途徑注射入心肌梗死大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BMSCs的定向遷移明顯增強，促進了細胞成活率，改善了左室重構，取得很好的療效〔8〕。

轉錄因子是細胞內(nèi)一類重要的調控蛋白，其特異地結合基因組DNA的順式作用元件以調節(jié)基因的轉錄過程，GATA轉錄因子基因家族具有與特定DNA結合的鋅指結構域，結扎左前降支造成心肌梗死后立即在梗死邊緣區(qū)注射GATA-4過表達的間充質干細胞，細胞釋放的細胞因子(IGF-1，VEGF)可促進血管生成和細胞存活，使細胞發(fā)揮更大的作用〔9〕。

炎癥在冠心病發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用，白介素18(IL-18)是一個重要的多效能炎癥細胞因子，IL-18結合蛋白(IL18BP)可拮抗IL-18的活性，過表達IL-18BP 的BMSCs可以促進VEGF分泌，減少細胞死亡，減小梗死面積，提高心功能〔10〕。趨化因子在炎癥反應中具有重要作用，它們結合到趨化因子受體而起作用，研究發(fā)現(xiàn)通過對BMSCs進行趨化因子受體CCR修飾，心肌內(nèi)注射可以減少心肌細胞凋亡，促進BMSCs向缺血區(qū)遷移，增加毛細血管密度，保護心功能〔11〕。腫瘤壞死因子(TNF)是一種真正的多效因子，具有多種生物學效應，心肌梗死時有炎癥介導TNF-α產(chǎn)生，用重組腺相關病毒(rAAV)使BMSCs 過表達TNF受體(TNFR)發(fā)現(xiàn)可以提高心梗后左室功能，改善BMSCs生存，提高TNF-α在心肌及血清中的表達水平，提高TNFR蛋白水平在心肌梗死區(qū)的表達，通過提高細胞存活率進而提高細胞移植的效率〔12〕。細胞因子種類繁多，參與人體多種重要的生理功能，還有許多因子尚處于體外研究階段，如何探討更合適的基因進行修飾，進一步改善梗死心肌局部的血液循環(huán)、提高移植后干細胞的存活，更好地改善心肌梗死及梗死后心功能是我們的研究方向。

3.2信號通路相關基因PI3K-Akt信號途徑是一條經(jīng)典的信號途徑，在細胞存活和抗凋亡中起重要作用。Akt又稱PKB，即蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，居PI3K/Akt信號傳導通路核心部位，Akt能磷酸化一系列蛋白成分，通過多種途徑抑制細胞凋亡，用腺病毒攜帶Akt修飾BMSCs可強化其修復豬心肌梗死后治療效果〔13〕。

Wnt信號通路在復制和分化中起重要作用，Wnt是一類分泌型糖蛋白，通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用。Wnt11通過激活Wnt11非經(jīng)典信號通路，在促進間充質干細胞向心肌細胞分化過程中發(fā)揮重要作用，Wnt11過表達的間充質干細胞移植能有效改善心功能〔14〕。糖原合酶激酶(GSK)3是生物體內(nèi)許多信號通路的參與者，是Wnt信號通路的上游作用物，過表達糖原合成酶激酶(GSK)-3β的間充質干細胞通過促進干細胞生存，促進干細胞向心肌分化，動員心臟祖細胞，分泌細胞因子，增強毛細血管密度顯著減小了心肌梗死面積，改善心肌梗死后心功能。研究還發(fā)現(xiàn)促生存作用及毛細血管密度增加主要是血管內(nèi)皮生長因子A起作用，但去除它后仍可有心肌梗死面積減小及心功能改善。由此可見GSK-3β修飾的間充質干細胞是通過多種機制協(xié)同起作用提高間充質干細胞的治療效率〔15〕。

分泌型卷曲相關蛋白2(Sfrp 2)是介導心肌存活和修復的重要干細胞分泌型蛋白，可以競爭結合wnt蛋白，從而抑制Wnt信號，其過量表達可以促使BMSCs體外增殖，增加毛細血管密度，縮小梗死面積，保護心功能，說明其自身具備保護缺氧受損的心肌細胞的功能〔16〕。

Notch 信號是細胞與細胞之間直接作用的主要信號通路之一，在細胞分化、血管生成以及機體發(fā)育過程中發(fā)揮極其重要的作用，在心血管系統(tǒng)它的影響包括血管重構、血管穩(wěn)定性以及心臟發(fā)育，Notch1是Notch的受體，它修飾BMSCs后能幫助BNSCs更好地進行心肌梗死后心肌修復及心功能的恢復〔17〕。

3.3其他基因經(jīng)基因修飾后，BMSCs相應的蛋白表達增加，干細胞的適應性增強，其修復能力加強。HSP20屬于熱休克蛋白(HSP)家族，是一個抗凋亡及抗氧化有關的酶，在缺血缺氧環(huán)境中對細胞具有保護作用，心肌梗死部位移植經(jīng)HSP20修飾的BMSCs能激活Akt，減少細胞凋亡，促進分泌VEGF，F(xiàn)GF-2和 IGF-1，進而促進血管密度，有益于治療心肌梗死〔18〕。

血紅素氧合酶(HO)是血紅素代謝途徑的起始酶和限速酶，HO-1又稱HSP32，是一種呈誘導性表達的酶，多種有害刺激均可誘導HO-1表達，，是細胞應激時重要的保護機制之一。HO-1修飾BMSCs 對移植到心肌梗死部位通過PI3K-Akt信號途徑促進VEGF分泌，抑制干細胞凋亡，能增強其在缺氧及惡劣環(huán)境中的生存能力，最終改善了心肌梗死的預后〔19〕。

Bcl-2是具有明顯抑制凋亡作用的基因，用陽離子脂質體法抗凋亡基因修飾BMSCs后，延長BMSCs 存活，有助于提高其移植治療心肌梗死的效果〔20〕。存活素(survivin) 是IAP家族中分子量最小成員，在胚胎和各類腫瘤中均表達，具有強大的調節(jié)細胞增殖和抗凋亡功能，用慢病毒載體使BMSCs高表達survivin，心肌梗死后移植與對照組比VEGF分泌及毛細血管密度增加，心肌梗死面積小，抑制膠原沉積，改善遠期預后〔21〕。E1A激活基因阻遏子(CREG) 是一種分泌型糖蛋白，CREG過表達明顯抑制BMSCs凋亡，主要是通過抑制線粒體凋亡途徑，使caspase-3減少，促進Akt磷酸化，減少p53表達，同時促進VEGF分泌，移植后可降低心肌梗死后心肌損害〔22〕。

3.4基因聯(lián)合單基因修飾BMSCs雖取得較好的療效。但由于心肌梗死心肌修復涉及多種機制，單種基因很難滿足治療需求，許多學者開始多基因修飾BMSCs的探索。如將Ang-1和Akt聯(lián)合修飾BMSCs移植治療心肌梗死，以滿足血管生成和抗凋亡需求，達到了預期的結果，大鼠心功能得到了進一步的改善并顯示出長期的治療效果〔23〕。同樣HGF及VEGF聯(lián)合，放大BMSCs的內(nèi)分泌效應，更好地改善心臟狀況〔24〕。采用Csx/Nkx2.5 and GATA-4兩種轉錄因子聯(lián)合修飾，提高BMSCs向心肌細胞分化效率，增強毛細血管密度，改善心肌梗死后心功能〔25〕。所有結果均表明，多基因聯(lián)合可起到一定的治療效果疊加。但目前還沒有公認的最佳基因改造方案，尋找更合適的基因聯(lián)合修飾BMSCs為提供了又一研究方向。

心肌梗死后最終引起心功能不全是患者死亡的主要原因?，F(xiàn)行的治療方法不能從根本上修復壞死的心肌組織。MSCs是人們研究最深入的干細胞種類之一，特別是在修復病患及損傷組織、器官方面。自體和異體的MSCs都被證明能夠參與組織再生。這類細胞易于采集、分離和體外擴增，避免了許多遺傳和倫理的問題，除具有多向分化潛能，還具有抑制同種異體免疫反應的免疫調節(jié)作用。該細胞易于接受基因修飾，不僅可作為組織工程的種子細胞，而且也可作為基因治療的良好工具。非病毒載體與病毒載體相比較無傳染性，沒有載體容量限制，材料來源廣泛，化學結構可控制，易于大量制備，在表達質粒、反義寡核苷酸或反義表達質粒真核細胞的靶向轉移中有著病毒載體不可替代的作用。然而，非病毒載體的轉導效率低，目的基因只能實現(xiàn)瞬間表達，其運送系統(tǒng)的顆粒較大，容易引發(fā)免疫反應和被機體所清除。目前對BMSCs的基因修飾研究主要為單一基因的動物試驗階段，然而體內(nèi)微環(huán)境是多種因子共同作用的結果，今后研究的方向是如何安全地將多種基因轉入體內(nèi)?；蚬こ淘贛SCs治療心肌梗死中有廣泛的應用前景。隨著研究的深入，會有更多的基因靶點和基因工程技術應用于心肌梗死的干細胞治療領域。

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〔2013-06-16修回〕

(編輯安冉冉)