曹志強，張翠彩，李秀文，蔣秀高

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測鉤端螺旋體的研究

曹志強，張翠彩，李秀文，蔣秀高

目的 利用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)，建立檢測鉤端螺旋體的方法。方法 選取鉤體LipL32基因，設(shè)計了LAMP引物。對27株鉤體、25株非鉤體樣本予以檢測，然后進行靈敏度和模擬樣本的研究。結(jié)果 擴增27株鉤體結(jié)果為陽性，擴增25株非鉤體結(jié)果為陰性。靈敏度為200拷貝/μL，模擬樣本檢測下限為200條鉤體/μL(煮沸法)和20條鉤體/μL(試劑盒提取法)。結(jié)論 LAMP實驗操作簡單，對設(shè)備要求不高，可以作為鉤體的快速檢測方法。

問號鉤端螺旋體屬；環(huán)介導等溫擴增；檢測；核酸擴增

鉤端螺旋體病(leptospirosis，簡稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)感染引起的人獸共患傳染病，流行范圍廣，危害大[1]?；疾〉膭游锘蛉丝赏ㄟ^排泄尿液的方式，將鉤體菌傳播到自然界，通過破損的皮膚或粘膜進入人體可導致人類的感染。在我國，鉤體病多發(fā)生于水稻種植區(qū)域，也是洪澇災(zāi)害時重點監(jiān)控的傳染病之一。為了有效控制鉤體病的發(fā)生，必須加強鉤體病的流行病學監(jiān)測，以便更好地控制鉤體病的發(fā)生和流行。目前鉤體檢測的方法很多，但存在一定的缺陷，比如鉤體菌分離培養(yǎng)受雜菌、抗生素等因素影響，培養(yǎng)陽性率不高，培養(yǎng)周期長；經(jīng)典方法顯微凝集試驗(microscopic agglutination test, MAT)適用于血清抗體檢測，需要對實驗所用鉤體進行接種培養(yǎng)[2]；普通PCR方法[3]和實時熒光定量PCR方法[4]近幾年被用于鉤體檢測方面，具有快速和靈敏的特點，但該檢測方法存在一定的操作復(fù)雜性和儀器昂貴等問題，在一些發(fā)展中國家和現(xiàn)場檢測方面受到限制。

LAMP技術(shù)是一種比較新的核酸等溫擴增技術(shù)，能在60～65 ℃常溫狀態(tài)下1 h左右的時間完成目的基因的擴增[5]。LMAP引物共有兩對，針對目的基因6個不同區(qū)域，具有很高的特異度和靈敏度。LAMP方法反應(yīng)時間短、結(jié)果判定方便、不需要昂貴的設(shè)備儀器，而且對模板的純度要求不高，大大減少了DNA提取和純化的時間，被廣泛應(yīng)用于病毒、細菌、寄生蟲的檢測和相關(guān)疾病的診斷。目前針對LMAP檢測致病性鉤體的目的基因主要有16S rRNA[6]和外膜蛋LipL41[7]。 本研究以鉤體外膜蛋白LipL32靶基因為目的基因，LipL32是鉤體表面重要蛋白，占75%的總蛋白含量，是引起人和動物免疫的重要蛋白[8]。以此設(shè)計引物，建立LAMP檢測技術(shù)進行擴增檢測，并對擴增產(chǎn)物進行電泳，并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用SYBR GREEN Ⅰ判定反應(yīng)結(jié)果，使LAMP的結(jié)果判定更簡單、直觀，為鉤體傳染監(jiān)測和臨床診斷提供快速可視化的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本研究選用的27株待測鉤體菌株由中國疾病預(yù)防控制中心鉤體病實驗室保存，代表了我國常見的致病性血清群、型，菌株由常規(guī)的EMJH培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10 d待用；其它25株非鉤體菌株DNA由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所萊姆病室、細菌耐藥室、應(yīng)急實驗室、呼吸道傳染病室提供，包括伯氏疏螺旋體、恙蟲病東方體、黑龍江斑點熱立克次體、貝氏柯克斯體、大腸埃希菌、糞腸球菌、屎腸球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、弗氏耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌、沙門菌、雷氏普羅威登斯菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌、痢疾桿菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌。

1.1.2 試劑和儀器 環(huán)介導等溫擴增DNA試劑盒(廣州迪奧生物科技有限公司)、反應(yīng)混合物置于Tubidimeter real-time LA-320c型LAMP實時濁度儀(日本榮研化學株式會社)、DL2000 DNA Marker和基因組DNA提純試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)、超純水(北京天根生化科技有限公司)、PCR反應(yīng)體系Premix(包括TaqDNA聚合酶、dNTPs mixture、buffer)為TaKaRA公司產(chǎn)品、PCR擴增儀(德國SensoQuest-LabCycler)、凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP EC3 Imaging System)、水浴鍋。

1.2 方法

1.2.1 LAMP鉤體檢測引物及其合成 通過NCBI網(wǎng)站下載我國15群15型鉤體標準參考菌株的LipL32序列，用Mega 5.2對序列進行多重比對，選定該15株致病性菌株中保守的一段序列。利用PrimerExplorer version 4(http://primerexplorer.jp/e/)設(shè)計引物，包括兩條外引物F3、B3和兩條內(nèi)引物FIP、BIP和一條加快反應(yīng)速率的環(huán)引物LB，引物序列詳見圖1、表1。

1.2.2 反應(yīng)體系及條件 LMAP體系及條件 根據(jù)相關(guān)參考文獻[6-7,9]和前期預(yù)實驗， 采用25 μL反應(yīng)體系，即：2×反應(yīng)混合液12.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，模板DNA 2 μL，外引物F3和B3的量各為5 pmol/L，內(nèi)引物FIP和BIP的量各為加40 pmol/L，環(huán)引物為20 pmol/L。雙蒸水4.5 μL補充至25 μL。上述試劑混勻后加入15～20 μL的密封液，混勻離心。將1 μL的的1∶1 000 SYBR GREEN Ⅰ顯色液滴在PCR管蓋中間，蓋緊管蓋，防止顯色液墜入反應(yīng)混合液中。反應(yīng)混合物置于IA-320c型LAMP實時濁度儀(日本榮研化學株式會社)，63℃反應(yīng)60～80 min，然后80 ℃滅活酶活性5 min。

普通PCR體系及反應(yīng)條件[3]：普通PCR采用荷蘭皇家熱帶研究院世界衛(wèi)生組織鉤體病參考中心設(shè)計的一對引物G1/G2，由北京康為世紀生物科技有限公司合成。引物序列為G1:5′-TGAATCGCTGTATAAAAGT-3′；G2:5′-GGAAAACAAATGGTCGGAAG-3′ 采用25 μL反應(yīng)體系：2 ×熱啟動Taq酶預(yù)混合的PCR反應(yīng)液(天根生化科技有限公司)12.5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，雙蒸水7 μL，DNA模板2 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，采用1.5%瓊脂糖凝膠，120 V電壓電泳30 min，凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.2.3 三種鑒定LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的方法 (1)用Tubidimeter real-time LA-320c型LAMP實時濁度儀實時監(jiān)測LAMP反應(yīng)情況，當縱坐標軸數(shù)值超過0.1時，判定為陽性。(2)利用電泳的方法判定結(jié)果。取5 μL擴增產(chǎn)物與1 μL 6×lodding buffer混合均勻，采用采用2%瓊脂糖凝膠，95 V電壓電泳50 min，凝膠成像儀觀察是否有梯形條帶產(chǎn)生，證實LAMP反應(yīng)的發(fā)生。(3) LAMP反應(yīng)完成后混勻顯色液與反應(yīng)液，肉眼觀察顏色的不同，擴增陰性的反應(yīng)液呈橘紅色，擴增陽性的反應(yīng)液呈黃綠色。

1.2.4 特異性檢測 樣品為代表我國主要常見致病性血清群、型的待測菌株共計27株，25株非鉤體菌DNA。鉤體菌經(jīng)EMJH培養(yǎng)基培養(yǎng)5～10 d后，按照基因組DNA提取試劑盒推薦步驟進行DNA提取，最后加入50 μL TAE溶解DNA。DNA的濃度的測定采用NanoDrop微量分光光度計(美國Thermo公司)。采用本研究中已設(shè)計的引物，分別對27株待驗證鉤體菌株DNA和25株非鉤體DNA進行LAMP擴增和PCR擴增。

1.2.5 LAMP靈敏度檢測及同普通PCR方法的比較 選取標準參考菌株56601，采用基因組提取試劑盒提取DNA，取1 mL濃度為1 ng/μL的DNA，10倍去離子水倍比稀釋8個樣本，用來研究LAMP檢測靈敏度。為了減少稀釋時的加樣誤差，分別進行3個系列的梯度稀釋，再將3個系列中相同濃度的稀釋液混合，DNA濃度從高(1 ng/μL)到低(0.1 fg/μL)的8個樣本，從中各取2 μL作為模板，每個樣本做3個平行反應(yīng)。

DNA濃度轉(zhuǎn)化為細菌拷貝數(shù)的計算方法[8]：拷貝數(shù)(copies/μL)=[(ng數(shù)×10-9次方)×(6.02×1023)]÷(堿基數(shù)×660) 經(jīng)查閱文獻及計算，鉤體全基因組DNA分子量為4 700 kb[10]，1 ng/μL濃度DNA拷貝數(shù)為2×105/μL。

1.2.6 模擬尿樣本檢測 模擬尿樣本的的方法：用0.010 mm細胞計數(shù)器和暗室顯微鏡對鉤體56 602菌株進行計數(shù)，取1 mL菌液(含2×108條鉤體)離心(1 300 g，3 min)，棄上層清液，將沉淀溶解于1 mL的健康成人尿液中，10倍體積尿液倍比稀釋8個梯度。設(shè)計兩組相同的模擬尿樣本，第一組采用煮沸法的方法，第二組采用基因提取試劑盒的方法。LMAP方法分別測定兩組模擬樣本的下限，熒光染料法判定結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 LAMP特異性檢測 如表2所示，本實驗所設(shè)計的引物能成功擴增具有血清代表性的27株鉤體，而不能擴增25株非鉤體，表明該方法具有較好的特異性。

表2 檢測27株鉤體和25株非鉤體的結(jié)果

Tab.2 Detection results of the 27Leptospiraand 25 other bacteria strains

2.2 LAMP靈敏度檢測

2.2.1 LAMP反應(yīng)過程的LA-320c型LAMP實時濁度儀測定 按照1.2.4所述，LAMP檢測 8個10倍梯度稀釋的DNA樣品，用LA-320c型LAMP實時濁度儀監(jiān)控反應(yīng)進程。據(jù)圖2，縱坐標軸為反應(yīng)濁度值，橫坐標軸為反應(yīng)時間。根據(jù)橫坐標軸的數(shù)值記錄，大約在35～49 min之間，前4個梯度的DNA依次起峰，1 min左右均到達0.1，此時可以判定為LAMP反應(yīng)結(jié)果陽性。隨著反應(yīng)體系內(nèi)各組分的不斷消耗，大約起峰后30 min左右，前4個反應(yīng)結(jié)束，產(chǎn)物量達到最大。LAMP反應(yīng)檢測下限為200 copy/μL(1 pg/μL)。

Real-time monitoring of LAMP reaction at 63 ℃ for 70 min by Tubidimeter LA-320c

圖2 LAMP檢測鉤體不同稀釋度DNA的濁度反應(yīng)曲線

Fig.2 Reaction curve of LAMP with serial dilution DNA

2.2.2 電泳判定LAMP產(chǎn)物 LAMP擴增8個10倍梯度稀釋的DNA樣品結(jié)束后，取5 μL擴增產(chǎn)物與1 μL 6×lodding buffer混合均勻，電泳、凝膠成像儀觀察，結(jié)果如圖3所示，可見泳道1—4有梯形條帶產(chǎn)生，泳道5—8和陰性對照泳道無梯形條帶的產(chǎn)生。證實前4個反應(yīng)管有LAMP產(chǎn)物，后四個反應(yīng)管無LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，LAMP反應(yīng)的檢測下限是200 copy/μL(1 pg/μL)，同LA-320c型LAMP實時濁度儀測定結(jié)果一致。

M: DL2000 Marker; 1-8: Lamp produncts from serial 10-fold dilution of DNA (1 ng/μL--0.1 fg/μL); NC: Negtive control.

圖3 LAMP檢測鉤體不同稀釋度DNA電泳圖譜

Fig.3 Electrophoresis of LAMP product for serial dilution DNA

2.2.3 LAMP產(chǎn)物的可視化鑒定比較 在LAMP反應(yīng)體系反應(yīng)結(jié)束后混勻顯色液SYBR GREEN Ⅰ與反應(yīng)液，通過肉眼觀察。結(jié)果如圖4所示，1—4樣品管呈黃綠色，反應(yīng)判定為陽性，4—8樣品管和陰性對照管呈橙紅色，反應(yīng)判定為陰性。可視化結(jié)果表明LAMP檢測鉤體DNA的靈敏度為200 copy/μL，與LA-320c型LAMP實時濁度儀測定結(jié)果、電泳成像結(jié)果一致，說明反應(yīng)結(jié)束后添加SYBR GREEN Ⅰ后所呈現(xiàn)的顏色反應(yīng)具有特異性。

Fig.4 Coloration of LAMP reaction products by SYBR GREEN Ⅰ

2.2.4 普通PCR方法檢測鉤體下限 按照1.2.4所述，普通PCR檢測 8個10倍稀釋梯度的DNA樣品，1號反應(yīng)管(模板濃度1 ng/μL)和2號反應(yīng)管(模板濃度0.1 ng/μL)PCR檢測陽性，檢測下限為0.1 ng/μL(2×104copy/μL)，靈敏度低于LAMP兩個數(shù)量級。

PC: Positive control; 1-8: PCR produncts from serial 10-fold dilution of DNA (1 ng/μL--0.1 fg/μL); NC: Negtive control.

圖5 PCR檢測鉤體不同稀釋度NDA的電泳圖譜

Fig.5 Electrophoresis of PCR product for serial dilution DNA

綜上所述：LAMP檢測的檢測下限為200 copy/μL，靈敏度比普通PCR高兩個數(shù)量級；LA-320c型LAMP實時濁度儀測定反應(yīng)曲線、SYBR GREEN Ⅰ可視化顏色鑒定及產(chǎn)物電泳圖譜三者結(jié)果一致。

2.3 LAMP檢測模擬尿樣本 如圖6所示，對于煮沸法提取DNA的模擬樣本實驗，前4個反應(yīng)管呈黃綠色，LAMP檢測陽性，后四個反應(yīng)管呈橙紅色，LAMP檢測陰性，模擬樣本檢測下限是200條/μL。對于采用DNA提取試劑盒法的模擬樣本實驗，前5個反應(yīng)管呈黃綠色，LAMP檢測陽性，后3個反應(yīng)管呈橙紅色，LAMP檢測陰性，模擬樣本檢測下限是20條/μL。

Fig.6 Coloration of LAMP reaction products of urine stimulants by SYBR GREEN Ⅰ

3 討 論

LAMP技術(shù)是最近發(fā)展起來的病原微生物診斷技術(shù)，該技術(shù)利用兩條內(nèi)引物(FIP，BIP)和外引物(F3，B3)分別識別目標DNA序列中6個特定區(qū)域，無需模板變性，在恒溫條件下(63～65 ℃)利用鏈置換(strand displacement)DNA聚合酶對目標DNA序列進行擴增反應(yīng)；并且，目標DNA序列中6個特定區(qū)域被引物正確識別后擴增反應(yīng)才會發(fā)生，因此LAMP技術(shù)具有極高特異性。環(huán)引物主要用來引導反應(yīng)過程中子代DNA形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中鏈的延伸，加速擴增反應(yīng)和提高反應(yīng)的靈敏度。LAMP擴增產(chǎn)物的檢測方法主要有3種：凝膠電泳檢測、濁度檢測和熒光顯色檢測。凝膠電泳檢測的本質(zhì)是用核酸染料對擴增得到的DNA進行染色，在紫外激發(fā)下顯影，這個方法可直接表現(xiàn)反應(yīng)體系中是否有DNA的合成。濁度檢測的原理是在LAMP反應(yīng)進行的過程中，隨著大量DNA的合成，還產(chǎn)生一種副產(chǎn)物焦磷酸根離子，焦磷酸根離子與體系本身就存在的鎂離子結(jié)合就形成了焦磷酸鎂沉淀，沉淀的產(chǎn)生可引起反應(yīng)液濁度的變化。而濁度儀的工作原理就是實時的檢測并記錄這種濁度的變化，沉淀的產(chǎn)生與DNA合成是同步的，濁度儀記錄的濁度達到0.1時，通過凝膠電泳檢測也可以看到特異的“梯形條帶”。SYBR GREEN Ⅰ顯色劑能與雙鏈DNA進行結(jié)合而發(fā)出熒光，與其他檢測方法相比，熒光顯色劑的應(yīng)用更簡捷、更直接。傳統(tǒng)的血清學試驗由于體內(nèi)抗體出現(xiàn)較晚，而血培養(yǎng)費時又易污染，常常延誤早期診斷時間，導致患者錯過最佳治療時間。普通PCR的檢測需要專門的PCR儀器，并需要電泳來檢測產(chǎn)物，耗時一般在2 h以上。LAMP是一種快速、簡便、可靠、擴增效率極高的的檢測方法，僅需要一臺水浴鍋，就可以在60 min內(nèi)完成對鉤體的檢測。LAMP檢測技術(shù)可以不用借助于凝膠電泳，直接在反應(yīng)前添加顯色劑就可以完成針對產(chǎn)物的檢測。整個檢測過程在封閉的反應(yīng)管內(nèi)完成，無需開蓋檢測，有效的避免了開蓋檢測造成的氣溶膠污染。

在本研究中我們首先運用LAMP方法實現(xiàn)對鉤體核酸的檢測。LipL32為致病性鉤體LipL32基因編碼表達的一種外膜蛋白，不存在于非致病鉤體中[10]，在這個研究中，我們針對保守性很好的LipL32基因設(shè)計LAMP引物，對鉤體DNA進行檢測，成功擴增出目的基因片段。通過比較普通PCR和LAMP在鉤體檢測的靈敏度和特異性方面的差異，為鉤體病的臨床診斷和環(huán)境監(jiān)測提供一種更為有效、簡便的方法。本實驗可以檢測出27株代表我國常見致病性的血清群、型的鉤體菌株，而其它非鉤體菌DNA檢測均為陰性，特異性良好；LAMP檢測的靈敏度為200 copy/μL，高于普通PCR兩個數(shù)量級， 這提示LAMP方法可以較好的應(yīng)用于現(xiàn)場鉤體監(jiān)測或者臨床檢測。而濁度檢測方法中，反應(yīng)添加熒光顯色，檢測過程中運用濁度儀針對擴增的過程予以實時濁度測量，最后對產(chǎn)物進行了電泳，結(jié)果表明，濁度儀的實時濁度、熒光顯色變化和電泳的檢測結(jié)果完全一致。最后，我們進行了人尿模擬樣本實驗，LAMP反應(yīng)對許多PCR擴增的干擾因子具有很好的耐受能力，可針對煮沸法粗提的DNA模板進行有效的擴增，減少了復(fù)雜的模板準備時間和DNA純化等過程。

綜上所述， 我們在對LMAP檢測鉤體的實驗過程中，可以看出LAMP技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，其優(yōu)點如下：1) 恒溫反應(yīng)，整個過程在63～65 ℃的普通水浴鍋內(nèi)進行，不需要昂貴的儀器設(shè)備； 2) 反應(yīng)快速，一般1 h可結(jié)束反應(yīng)； 3) 檢測靈敏度比普通PCR方法高兩個數(shù)量級；4)操作簡單、費用低，無需電泳，添加顯色劑即可判定反應(yīng)結(jié)果，能用于儀器設(shè)備簡陋的基層實驗室及現(xiàn)場快速檢測。

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Leptospira interrogans DNA detection by loop-mediated isothermal amplification

CAO Zhi-qiang,ZHANG Cui-cai,LI Xiu-wen,JIANG Xiu-gao

(National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China)

Loop-mediated isothermal amplification has been widely used in pathogenic bacteria inspection. There is a lack of diagnostic tests for leptospirosis in technology-restricted settings or in emergency assistance activities. We developed and evaluated a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for the rapid detection of pathogenicLeptospiraspp. through amplification of lipL32 gene coding for the outer membrane protein LipL32. Specificity was high as we observed positive reactions of 27 pathogenic strains but negative reactions for other bacterial species. The lower limit of detection was 200 genomic equivalents/μL, and the sensitivity of LAMP was 100 times higher than that of PCR. The method enables detection of 200 leptospiral cells/μL following boiling of specimens and 20 leptospiral cells/μL of DNA extraction kit means. The lamp assay is easy to perform and inexpensive, so might be applied in the rapid and specific diagnosis ofLeptospira.

Leptospira; loop-mediated isothermal amplification; detection; PCR

Jiang Xiu-gao, Email:jiangxiugao@icdc.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.001

蔣秀高，Email：jiangxiugao@icdc.cn

中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206

R377

A

1002-2694(2015)04-0293-05

2014-08-28；

2014-11-12

國家科技重大專項 (No.2013ZX10004-101 & No.2012ZX10004-215)

Supported by the National Science and Technology Major Project (Nos. 2013ZX10004-101 and 2012ZX10004-215)