劉超 李志偉 張艷橋

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個多基因共同參與、涉及多條信號通路、緩慢而持續(xù)的過程[1]。在后基因組時代，得益于高通量測序技術和生物信息學技術的高速發(fā)展，研究者們從不同的腫瘤細胞中獲得了大量的基因組信息。這些基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，不同的基因在同一發(fā)展階段，甚至同一個基因在不同的階段都發(fā)揮著不同的生物學作用。如何探索這些基因與腫瘤的關系成為了研究者們面臨的最重要的挑戰(zhàn)。所以，對于腫瘤相關基因的功能研究，需要在不同的細胞分化階段，對不同的基因表達進行有效的干擾，并以此為基礎研究該基因對于腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響。為此，研究者們迫切需要一個快速且有效的基因編輯技術，來人為地控制細胞內基因的表達水平。CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated nuclease 9）基因編輯技術，相對于傳統(tǒng)的基因編輯技術，如鋅指核酸內切酶（zinc finger endonuclease, ZFN）[2]和類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activatorlike effector nuclease, TALEN）[3]以及小片段干擾RNA技術后，更進一步地填補了研究者們在此方面的空缺，并且從多個方向快速地推進了腫瘤研究的進展。

1 關于CRISPR/Cas9基因編輯技術的介紹

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細菌和古細菌在不斷進化的過程中產(chǎn)生的適應性的免疫防御機制，用來保護自身的基因組免受外源核酸如噬菌體、病毒等的干擾和破壞[4]。CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一套適應性免疫系統(tǒng)，他應用CRISPR RNA（crRNA）以堿基互補的形式引導Cas蛋白識別入侵的外源基因組，并對其DNA進行剪切。根據(jù)Cas蛋白的序列和結構將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為I型、II型和III型[5]。其中I型和III型系統(tǒng)都需要多個Cas蛋白原件，而II型僅僅需要Cas9蛋白[6]。II型CRISPR/Cas系統(tǒng)（即CRISPR/Cas9系統(tǒng)）已經(jīng)在化膿鏈球菌[7]和奈瑟球菌[8]內重點研究，并且已被發(fā)展成為一套理想的程序化的基因編輯工具。

1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成結構

1.1.1 Cas9核酸內切酶（CRISPR-associated nuclease 9） Cas9核酸內切酶是II型CRISPR/Cas系統(tǒng)最必不可少的組成元件，他能夠以針對具有特異性DNA序列的DNA進行雙鏈剪切[5]。Cas9核酸內切酶是一個大的多結構域蛋白，其中兩個核酸內切酶結構域分別為：位于N端的RuvC核酸內切酶樣的結構域，以及一個在中部有類似HNH核酸酶的活性的結構域。在體外實驗中已經(jīng)證實，化膿鏈球菌內的Cas9蛋白可以對靶DNA造成雙鏈斷裂切口。其中，HNH核酸內切酶結構域完成對與crRNA互補鏈的剪切，而RuvC樣核酸內切酶切割另外一條非互補鏈[9]。有趣的是，當對這兩個內酸酶位點進行突變后，并不影響CRISPR/Cas9復合體與外源性間隔序列位點的結合。另外，在間隔序列旁有一段保守的短的核酸序列，如NGG、NGGNG、NAAR和NNAGAAW，即間隔序列臨近基序——PAM結構（protospacer adjacent motif），對于Cas9蛋白進行結合和剪切都是至關重要的[10]。不同的微生物需要不同的PAM結構，但是對于Cas9蛋白需要識別特異的PAM結構的機制仍然是未知的[11]。

1.1.2 反式激活crRNA（transactivating crRNA, tracrRNA）tracrRNA是CRISPR/Cas9系統(tǒng)第二個組成的部分，他是一個非蛋白編碼RNA，主要用來完成crRNA的成熟和之后的DNA剪切[12]。在化膿性鏈球菌中，tracrRNA由兩個起始位點轉錄產(chǎn)生分別長度為171個核苷酸和89個核苷酸序列前體tracrRNA，隨后兩者再進一步加工成為75個核苷酸的成熟體tracrRNA。tracrRNA前體的一部分序列能夠與crRNA前體互補，有助于crRNA的成熟[7]。

1.1.3 CRISPR RNA（crRNA） CRISPR RNA攜帶著CRISPR/Cas系統(tǒng)中間隔序列的序列，負責捕捉外源性的DNA序列，起到復合體定位的功能。在化膿鏈球菌中，前體crRNA（pre-crRNA）是一條長度為511個核苷酸的RNA，他包括一個前導區(qū)和一系列重復-間隔-重復的序列組成[7]。前體crRNA需要借助tracrRNA、RNaseIII以及Cas9蛋白經(jīng)過兩步剪切才能成為成熟的crRNA，其長度約為39個-42個核苷酸序列，其中包括一個獨一無二的20個核苷酸的間隔序列和一個19個-22個核苷酸長度的重復序列。這些序列可以特異性地識別到入侵基因組的剪切位點，指導CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因編輯。

1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用過程

1.2.1 CRISPR序列的捕獲與記憶 在初始階段，噬菌體或外源性的核酸首次入侵細菌時，CRISPR系統(tǒng)需要把外源核酸上的一部分序列即原間隔序列整合到宿主基因組上成為間隔序列，然后這部分儲存在間隔序列內的信息再用于抵抗外源基因的干擾[13]。所以起始階段屬于CRISPR系統(tǒng)行使功能的適應階段。大量研究發(fā)現(xiàn)所有的CRISPR系統(tǒng)中都含有Cas2基因編碼區(qū)，表明Cas2在CRISPR系統(tǒng)作用的過程中起著非常重要的作用，研究結果也表明Cas2參與了新的間隔序列的形成[5]。同時，研究發(fā)現(xiàn)在CRISPR基因座上臨近間隔序列的附近有幾個非常保守的核苷酸的序列，稱為間隔序列臨近基序——PAM。不同的細菌和古細菌需要不同的PAM結構，在化膿鏈球菌中的II型CRISPR系統(tǒng)的PAM結構序列為NGG。PAM結構的作用是將間隔序列定位于入侵的噬菌體或質粒的DNA序列中，即宿主對入侵的外源核酸進行掃描，在其DNA序列中定位若干個PAM，并將PAM結構旁的序列定義為新的原間隔序列并被剪切后陸續(xù)的整合到CRISPR系統(tǒng)新合成的兩個重復序列之間。以此完成對外源核酸序列的捕獲和記憶。

1.2.2 CRISPR系統(tǒng)的轉錄與轉錄后加工 CRISPR系統(tǒng)的表達包括tracrRNA和crRNA的轉錄與成熟過程。重復序列和間隔序列在前導序列的啟動下進行轉錄形成pre-crRNA，pre-crRNA通過剪切形成成熟的crRNA。以化膿鏈球菌內的II型CRISPR系統(tǒng)為例[7]，tracrRNA由兩個起始位點轉錄產(chǎn)生長度分別為171個核苷酸和89個核苷酸序列的前體tracrRNA，隨后二者再進一步加工成為75個核苷酸的成熟體tracrRNA。前體tracrRNA的一部分序列能夠與crRNA前體互補，有助于crRNA的成熟。Pre-crRNA需要借助tracrRNA、RNaseIII以及Cas9蛋白經(jīng)過兩步剪切才能成為成熟的crRNA，crRNA長度約為39個-42個核苷酸序列，其中包括一個單獨的20個核苷酸的間隔序列和一個19個-22個核苷酸長度的重復序列。正常情況下細菌中的CRISPR的表達水平比較低。但是，當噬菌體或外源質粒再次入侵時，CRISPR會被迅速地誘導表達上調。

1.2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)對外源核酸進行剪切 成熟后的crRNA與tracrRNA會有部分互補的區(qū)域，從而形成雙鏈的RNA，再與Cas9蛋白共同形成核糖核蛋白復合物。crRNA上的間隔序列會特異性地結合到外源核酸與其互補的序列上，然后解開DNA雙鏈，形成R環(huán)使crRNA與互補鏈雜交，另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)，然后由復合體中Cas9蛋白中HNH結構域剪切與crRNA的互補DNA鏈，RuvC結構域剪切非互補鏈。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)復合體的作用下，外源性的核酸會在特定的位置被剪切，形成雙鏈斷裂切口（double strand break, DSB），從而完成細菌對外源核酸的干擾[9]。

1.3 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因編輯的作用過程 基于對II型CRISPR/Cas系統(tǒng)即CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究，研究者們已經(jīng)將該套系統(tǒng)改造成為一套理想的程序化的基因編輯工具。Cas9介導的基因編輯依賴兩個連續(xù)的步驟：首先，Cas9核酸內切酶在crRNA的介導下對基因組DNA進行剪切；然后，DNA的DSB會被細胞內天然的DNA修復系統(tǒng)進行修復[14]。

首先利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)剪切特定的DNA序列，需要三個重要的元件，包括：Cas9蛋白、tracrRNA、依據(jù)需要設計的特異性地crRNA。將這三個元件轉染到目標細胞內，當該系統(tǒng)表達時，其tracrRNA會與crRNA形成雙鏈RNA并定向地與目標DNA結合，同時Cas9蛋白會對目標DNA的正鏈和反鏈進行剪切，形成DSB，隨后細胞會啟動天然的DNA修復系統(tǒng)，完成DNA的修復。研究發(fā)現(xiàn)，將pre-crRNA和tracrRNA構建成一個融合RNA（single-guide RNA, sgRNA）來模擬成熟的crRNA和tracrRNA，同樣可以與Cas9共同作用特異地切割目的DNA，從而將CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡化成Cas9蛋白和sgRNA兩個組分。在大多情況下，Cas9蛋白和sgRNA兩個組分切割DNA的效率比Cas9蛋白、pre-crRNA和tracrRNA三個組分的效率高。

DSB修復的方式有兩種，一種是非同源末端連接（native nonhomologous end joining, NHEJ）[15]，這種修復方式往往會導致隨機的小片段的缺失或者插入（indels）以此來導致靶基因的故障，但這種編輯方式是不能夠進行精確控制的；另一種是同源重組介導的修復（homology-directed repair, HDR）[16]，在雙鏈DNA斷點產(chǎn)生后，同時引入模板DNA序列，這部分序列根據(jù)需要，插入特定的一段序列（knock in）、刪除特定的序列（knock out）或突變特定的堿基或序列，這時候通過同源重組的作用進行斷鏈修復，就可以把需要編輯的序列引入到特定的位點，以此完成精確的基因編輯。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術在腫瘤研究中的應用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一個新興的基因編輯技術，目前在生物學領域內，對該系統(tǒng)的應用模式主要集中在以下三個方向：①利用CRISPR/Cas9基因編輯技術定點編輯目標基因，目前已廣泛應用于各種真核、原核生物的基因工程方面[17]；②基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組規(guī)模的基因編輯，再結合高通量測序技術篩選與表型相關基因的技術[18]；③利用滅活核酸酶活性后的Cas9（dCas9），將其改造成為一個利用RNA引導的歸航裝置，并通過改變與dCas9相融合的效應器來擴展該系統(tǒng)更加廣泛的用途[19]。目前，在腫瘤的研究中CRISPR/Cas9基因編輯技術也被廣泛應用，并獲得了許多令人欣慰的成果。

2.1 研究基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展相關機制中的應用

2.1.1 白血病相關基因功能研究 先天性和獲得性的7號染色體長臂缺失，常見于骨髓異常增生綜合癥和急性粒細胞白血病中，并且往往提示與不良預后相關[20]。但是對于位于7號染色體長臂上的相關抑癌基因的功能的研究目前尚不清晰。組蛋白H3K4三甲基化轉移酶（MLL3）是7號染色體上的一個抑癌基因，他屬于MLL蛋白家族，可以對H3K4位置的賴氨酸進行甲基化，進而影響相關基因的轉錄活性[21]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該基因在結腸癌、髓母細胞瘤、乳腺腫瘤、白血病等疾病中廣泛存在[22,23]。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對可以完成對單條或者兩條等位基因的編輯。有研究[24]利用該技術對MLL3基因進行編輯，并獲得了該基因表達水平下調至野生型的50%水平的小鼠模型。以此為基礎，配合其他因7號染色體長臂缺失的事件，最終促進白血病的發(fā)生。有趣的是，MLL3半數(shù)抑制后導致的白血病，與人類7號染色體缺失或者7號染色體長臂缺失后導致的白血病一樣，都是對常規(guī)化療的敏感性欠佳，而對BET抑制劑JQ1有較好的療效。因此，研究者們認為他們構建的小鼠模型成功地證實了MLL3基因是7號染色體長臂上的一個單倍劑量不足的抑癌基因，并且為這種嚴重的疾病的治療提供了一個新的策略。

2.1.2 實體瘤相關基因功能研究 CRISPR/Cas9技術同樣運用到了對實體瘤的研究中，以一項關于直腸癌與PIK3R1基因關系的研究為例[25]。在這項研究中，研究人員利用CRISPR/Cas9技術在直腸癌細胞系水平上敲除PIK3R1基因，之后分別檢測該敲除細胞系與野型細胞系在上皮細胞間質化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）及細胞增殖、腫瘤細胞干細胞特性等方面的變化，以此證明PIK3R1基因具有調節(jié)直腸癌細胞的侵襲轉移及腫瘤干細胞特性的功能。

2.2 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術建立小鼠腫瘤模型腫瘤模型的建立，為研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制和對治療探索提供了極大的幫助。小鼠模型是目前可以整合基礎和臨床腫瘤研究的理想載體，已廣泛應用于腫瘤研究的各個領域。小鼠腫瘤模型按照建立的方法可分為以下幾類[26]：①自發(fā)和誘發(fā)小鼠模型；②移植型小鼠模型；③基因敲除小鼠模型；④轉基因小鼠模型等。

基因敲除小鼠腫瘤模型是指利用基因敲除的方法去除抑制腫瘤發(fā)生相關的基因，從而誘導小鼠腫瘤發(fā)生的小鼠模型[27]。這對于認識單一基因或數(shù)個基因在腫瘤發(fā)生中的作用而言，是一個理想模型。在過去30年中，基因編輯技術的開發(fā)和進步，同樣促進了用于研究人類惡性腫瘤特點的小鼠腫瘤模型。2014年，在Nature和Cell雜志上分別介紹了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建的小鼠腫瘤模型。

2.2.1 小鼠肝癌模型 利用小鼠模型對癌癥基因的研究，傳統(tǒng)上多是采取在受精卵水平上進行基因編輯，然后將該編輯后的受精卵培養(yǎng)成為成鼠[28]。在這篇Nature的文章中，張鋒的研究團隊介紹了一種新的構建小鼠基因敲除腫瘤模型的方法，即利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在野型小鼠的體內進行基因編輯[29]。研究者們利用小鼠尾靜脈液壓注射技術，將表達有Cas9核酸內切酶和一個sgRNA的DNA質粒注射入小鼠肝臟，同時或者單獨對小鼠的Pten和P53抑癌基因進行編輯。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導Pten突變后的小鼠，會導致Akt磷酸化水平的升高，以及過多的脂質在小鼠肝臟細胞內積聚。與此同時，研究者們同樣利用傳統(tǒng)的基因編輯技術——Cre-loxP重組酶系統(tǒng)模擬了小鼠敲除Pten和p53后導致的肝癌模型的表型，與前者表型一致。通過對小鼠肝臟和腫瘤組織的DNA測序，發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中存在抑癌基因Pten和p53雙等位基因插入或者缺失的突變。此外，研究者們還利用CRISPR系統(tǒng)，將Cas9表達質粒、靶向β-catenin的sgRNA以及能夠誘導β-catenin突變的寡鏈核苷酸共同注射入小鼠體內，導致小鼠肝細胞內發(fā)生突變后的β-catenin蛋白發(fā)生核移位，最終導致小鼠肝臟的癌變。這項研究揭示了新興的基因編輯技術CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在小鼠肝細胞內直接進行抑癌或者原癌基因編輯的可行性，并且提供了肝癌模型構建的新方法，同時為基因組學的研究提供了新的思路。

通過該項試驗，研究者們證實了利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在成年小鼠的肝臟內進行抑癌基因和原癌基因的編輯。這種方法避開了在胚胎干細胞水平上進行的編輯，以及飼養(yǎng)雜合體小鼠的繁瑣。另外，借助腺病毒的方式、更加高效的sgRNA以及更長的相互匹配的模板，這些比之前更加有效的遞送技術，也許能夠提高該項技術的編輯效率，并有機會擴展更多的器官適用于此?？傊@項研究擴展了CRISPR/Cas9技術的應用，使之更加廣泛，并且推動了小鼠腫瘤模型研究的發(fā)展。

2.2.2 小鼠肺癌模型 在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建小鼠肝癌模型后不久，張鋒及其團隊的研究人員又成功利用該技術構建出了小鼠肺癌模型[30]。與之前構建小鼠肝癌模型的方法不同的是，研究者們首先構建出了Cas9基因敲入小鼠。這一模型小鼠簡化了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體內進行基因編輯的步驟，并提高了編輯效率。利用這一新型的Cas9小鼠，研究人員成功編輯了小鼠體內的各種細胞類型的多個基因，并成功構建出了小鼠肺腺癌模型。

為了擴展CRISPR/Cas9技術在體內進行基因編輯的應用，研究者們利用Cre-loxP系統(tǒng)將Cas9基因敲入小鼠體內，構建出一個細胞內能夠穩(wěn)定表達Cas9核酸內切酶的小鼠（Cas9小鼠），這樣便克服了向成鼠體內導入Cas9蛋白的困難。隨后，研究者們分別在體內和體外，利用腺病毒、慢病毒以及顆粒介導的形式對小鼠的神經(jīng)細胞、免疫細胞和內皮細胞內轉導入sgRNA。利用這些小鼠，研究者們選擇了三個基因，即KRAS、p53和LKB1，當這些基因發(fā)生突變時能夠誘導肺腺癌的發(fā)生。然后，利用腺病毒的形式向該Cas9小鼠中，導入p53和LKB1基因的sgRNA以及利用同源重組的方式來編輯KRAS基因，致其發(fā)生突變，最終導致在小鼠體內出現(xiàn)肺腺癌的病理變化。結合研究人員的研究結果，證實了Cas9小鼠模型在生物學和疾病建模中的廣泛應用。

目前，該小鼠模型已經(jīng)被提供給全世界范圍內的多家科學團隊，研究人員們正在利用該小鼠模型繼續(xù)進行基因組學的研究。

2.2.3 小鼠白血病模型 近年來基因組測序研究的結果顯示，在人類惡性腫瘤的發(fā)生過程中，往往存在4個甚至更多個基因的突變，但是利用傳統(tǒng)的小鼠模型育種方法，很難在小鼠模型中模擬出這種基因突變的復雜性。2014年6月在Nature子刊上刊登了一篇文章介紹了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術克服了這一限制[31]。來自美國哈佛醫(yī)學院的研究人員仍然利用慢病毒轉導的方式，將sgRNA和Cas9共同遞送入同一只小鼠的造血干細胞中，對其中的5個基因同時進行編輯，從而導致小鼠骨髓惡性腫瘤的發(fā)生。因此而獲得的該急性粒細胞白血病模型小鼠能夠成功地與白血病患者中出現(xiàn)的轉錄因子、信號通路的相關的細胞因子等基因突變相匹配。這項研究結果向我們展示了，利用慢病毒轉導sgRNA和Cas9的系統(tǒng)進行基因編輯，能夠被用來進行體內的多基因突變腫瘤模型的構建，從而更好地模擬人類疾病的復雜性。

2.3 利用CRISPR衍生技術篩選與腫瘤表型相關的基因 得益于CRISPR/Cas9技術在基因編輯方面的高效性，在同一個細胞系中在基因組規(guī)模上，同時進行多個基因的編輯成為了可能。因此，研究人員們可以在基因組規(guī)模上，篩選出細胞內的哪些基因和研究者們感興趣的表型相關。利用慢病毒轉導的方式可以同時向細胞內轉導入成千上萬個靶向不同基因的sgRNA。最近，多篇文章的發(fā)表，證實了這種篩選方式在人類細胞中陰性和陽性的篩選能力。以往在基因組規(guī)模上進行這種功能缺失的篩選都是應用的RNAi的方法[32]，但是這種方法僅僅能夠讓基因的表達水平下調，并且有著較為嚴重的脫靶效應。相反，Cas9介導的sgRNA文庫篩選系統(tǒng)已經(jīng)被證實具有更高的篩選敏感性，而且?guī)缀蹩梢园邢蛘{節(jié)任何一段DNA序列[33-35]。在將來利用sgRNA篩選文庫可能會擴展到對非編碼基因序列的篩選中[34]。

另外，隨著dCas9（endonuclease-de ficient Cas9即核酸內切酶活性缺失的Cas9）技術的發(fā)展及應用，通過將不同的功能原件與其融合，基因篩選的方式可能不再只是功能缺失表型的篩選[18]。例如，將dCas9與轉錄激活原件融合，就可以進行功能獲得表型的基因篩選。

2.3.1 利用GecKO文庫篩選與黑色素瘤耐藥相關的基因2014年Science和Nature雜志上連續(xù)報道了3篇關于利用Cas9技術在人類細胞中進行基因篩選的文章[18,36-38]。其中，張鋒及其團隊[18]構建出了靶向人類基因組中18,080個基因的龐大的sgRNA文庫，并命名為GecKo（genome-scale CRISPR-Cas9 knockout）Library。在這個文庫中，設計人員們針對每一個基因設計了3個-4個sgRNA，即整個文庫包含了64,751個不同的sgRNA。結合慢病毒轉導和高通量測序的方法，最終完成該文庫對表型相關基因的篩選。

首先，研究人員利用該文庫對黑色素瘤細胞和多能干細胞的必需基因進行了陽性和陰性篩選。接下來，研究者們在黑色素瘤A375細胞系中利用GecKo文庫篩選了黑色素瘤細胞中與vemurafenib（一種RAF抑制劑）耐藥相關的基因。通過高通量測序后的對比，研究人員最終得到了6個高度可疑的候選基因，其中NF1和MED12基因已經(jīng)在以前的研究中被證實與該藥物耐藥相關，另外還有基因NF2、Cul3、TADA2B和TADA1，這4個基因是新發(fā)現(xiàn)的可能與該藥物耐藥相關的基因。

2.3.2 利用GecKO文庫篩選與肺癌轉移相關的基因 2015年2月，張鋒教授及其研究團隊[39]再接再厲，在Cell雜志上發(fā)表了最新的研究成果：利用CRISPR/Cas9技術改造的GecKo文庫在小鼠體內篩選出和腫瘤細胞生長和轉移相關的基因。在這項研究中，研究人員選擇了一個非小細胞肺癌的細胞系——KPD，然后借助慢病毒載體，將融合有GFP的Cas9基因序列整合到該細胞系基因組中，構建出Cas9-GFP-KPD細胞系。接下來研究人員將之前構建的mGecKoa文庫（包括67,405個sgRNA分別靶向20,611個基因和1175個microRNA）仍然以慢病毒的形式轉導入Cas9-GFP KPD細胞系中，并在體外培養(yǎng)一周。之后，將該轉導有Cas9及sgRNA文庫的細胞系及未經(jīng)文庫干擾的細胞系分別植入裸鼠體內。將小鼠培養(yǎng)一段時間后，比較兩組小鼠腫瘤生長及轉移情況，結合高通量測序技術，得出差異性基因，提示這些基因與非小細胞肺癌生長和轉移相關。

2.3.3 CRISPR介導的基因表達調節(jié)篩選白血病的抑癌基因 對于哺乳動物來說，細胞內同一個基因的表達水平在不同的細胞類型以及疾病發(fā)展的不同階段是不一樣的，但是研究者們對這種轉錄水平的變化的了解卻是相對落后的。有文獻[33]展示了一項新的系統(tǒng)，能夠用來系統(tǒng)地研究細胞內基因在轉錄水平下調和上調時的變化。首先，研究人員通過將融合有轉錄抑制結構域的dCas9（即CRISPRi技術），靶向到基因序列啟動子附近的不同位置，從而達到不同的干擾效果。并以此建立標準，最終能夠可控的、在最小脫靶的情況下將基因表達水平下調90%-99%。然后，將轉錄激活結構域融合到dCas9上，來激活基因的表達（CRISPRa技術）。結合這兩項技術，最終可以把基因的表達水平調節(jié)在0.1倍-10倍的范圍內。利用這一標準，研究人員構建出了一個基因組規(guī)模的CRISPRi和CRISPRa文庫，并利用此文庫進行基因的篩選。通過白血病細胞生長為基礎的篩選，可以篩選出細胞生長的必需基因、腫瘤的抑癌基因和調節(jié)細胞分化的基因。另外，研究者們還利用此文庫進行了細胞對一種霍亂和白喉融合毒素的耐藥和敏感表型的基因篩選，并以此建立了一個假想的信號通路圖?；谶@些研究結果，設計者們認為，CRISPRi和CRISPRa文庫可以作為一個有力的工具，提供豐富且完整的信息以探索復雜的信號通路。

2.4 在腫瘤基因治療中的探索應用 基因治療是指通過特殊的方法改變患者的遺傳物質，將人的正?；蚧蛘哂兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導入患者的靶細胞，直接針對患者的異?；虮旧磉M行的治療，從而達到治療疾病的目的[40]。腫瘤的基因治療具有特異性、安全性、有效性的特點，是目前腫瘤治療研究領域的熱點。

2.4.1 膀胱癌基因治療研究中的新思路 在全世界范圍內，膀胱癌都是一個非常常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤。傳統(tǒng)上針對于膀胱癌的治療多是化療或者放療，但是這些治療往往會殺死除腫瘤細胞以外的正常細胞，從而導致嚴重的副作用和治療失敗[41]。而針對于人類腫瘤相關基因的基因治療策略，是一個非常具有前景的膀胱癌治療方式。利用這種治療策略，需要啟動凋亡和細胞毒性的基因，而且只有腫瘤細胞才會表達活躍的啟動子進行基因編輯，從而特異性地誘導腫瘤細胞的凋亡或壞死。但是在腫瘤細胞中尋找這種特殊的啟動子是很困難的，因為某些基因雖然在某個器官的腫瘤細胞內表達活躍，這個基因也有可能在其他不同組織的正常細胞內也會表達水平相對活躍。這就造成了以下困難：首先是這種治療策略的低效性；其次就是很多特殊的腫瘤基因啟動子往往是低表達的。因此，現(xiàn)在亟需一個能夠提高腫瘤基因治療效率和可行性的方法。

在這項實驗中，研究人員就巧妙地運用了CRISPR/Cas9基因編輯技術和邏輯通路的原理，解決了上述問題[42]。在這里，研究人員設計出一種基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的邏輯通路，輸入端是由兩個啟動子組成，在細胞系內只有當這兩個輸入端口同時被激活時，輸出端的基因才會被激活。首先研究者分別將腫瘤特異性高表達啟動子hTERT與sgRNA融合，將膀胱的組織特異性高表達啟動子hUPII與表達Cas9的基因融合。當細胞系同時存在這兩個啟動子高表達時，才能激活CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對其下游基因進行編輯，從而激活輸出端基因。該實驗中，分別利用熒光素酶報告基因，與細胞凋亡相關的BAX基因，與細胞生長相關的p21基因，與腫瘤細胞轉移相關的E-cadherin基因作為輸出基因。實驗證明，只有在膀胱癌的細胞系中，邏輯通路才會激活這些輸出基因，從而誘導腫瘤細胞表型的進一步變化。這項研究為腫瘤基因治療的研究提供了新的思路。

2.4.2 治療HPV感染導致的宮頸癌的研究 高危型人乳頭狀瘤病毒癌基因（E6和E7）表達異常是宮頸癌發(fā)病的重要原因[43]。所以，這兩個病毒癌基因也被視為重要的治療靶點。為了開發(fā)特異性的針對HPV感染相關腫瘤的基因治療的策略，研究人員基于CRISPR/Cas9技術建立了靶向編輯E6、E7基因的編輯系統(tǒng)，并將該系統(tǒng)轉染入感染HPV-16病毒陽性的宮頸癌細胞系——SiHa細胞[44]。結果表明，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行E6、E7基因及其啟動子的編輯后，會導致p53和p21蛋白在細胞內的積累，從而顯著降低宮頸癌細胞系在體外的增殖能力。隨后，研究人員進行了裸鼠的皮下接種腫瘤細胞的實驗，構建皮下植瘤的動物模型。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向編輯E6、E7基因后的腫瘤細胞接種的小鼠體內，腫瘤的生長受到顯著抑制。這項研究結果為CRISPR/Cas9系統(tǒng)在靶向編輯高危型HPV致癌基因的基因治療中的應用提供了證據(jù)；并且作為一種新的治療策略，在宮頸癌和其他HPV相關癌癥的治療中提供了新的思路。

2.5 在腫瘤的其他研究方面中的應用

2.5.1 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建腫瘤相關染色體易位模型 人類腫瘤相關的染色體易位往往是通過兩個DSB產(chǎn)生的非同源染色體的異常接合形成[45]。在研究白血病和肉瘤發(fā)病的初始機制時，需要一個有效的方法能夠精確的重現(xiàn)這種腫瘤相關的染色體易位。有研究人員[46]利用gRNA介導的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在體外特定的位點構建出這種癌癥相關的染色體易位。利用這一方法，Rodriguez-Perales成功地在人類細胞系和原代細胞中模擬出與急性骨髓性白血病和尤因氏肉瘤高度一致的模型。利用熒光原位雜交技術（fluorescencein situhybridization,FISH）和分子分析對這些編輯后的細胞的融合基因的mRNA和蛋白水平進行檢測，顯示出CRISPR-Cas9方法的可靠性和精確度，這為染色體易位相關腫瘤的研究提供了一個有力的工具。

2.5.2 在腫瘤相關miRNA研究中的應用 microRNA能夠調節(jié)血管生成的平衡[47,48]。最近的一項研究[49]表明，當所有microRNA枯竭，會導致腫瘤的血管生成受到抑制。研究人員通過敲除Dicer1形成microRNA缺陷的腫瘤。這些腫瘤處于高度缺氧狀態(tài)，但是其血管生成不良，提示了其血管生成相關信號的不足。通過基因表達譜檢測分析，由于microRNA枯竭，導致了血管生成基因的表達顯著下調。但是，在這一背景下，F(xiàn)IH1（HIF-1抑制因子）卻是激活的狀態(tài)，進而能夠抑制HIF的轉錄活性。隨后，在microRNA缺陷的細胞系中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除FIH1基因，這時，HIF-1的轉錄活性、血管內皮生長因子的產(chǎn)生、腫瘤缺氧和腫瘤血管生成的情況都會較之前有相反的變化。繼續(xù)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對FIH1基因非編碼區(qū)中的microRNA的結合位點進行編輯，則會出現(xiàn)FIH1蛋白的表達正常，但是細胞對缺氧環(huán)境的反應能力卻未能恢復。這些研究結果表明，microRNA能夠通過抑制FIH1基因來促進腫瘤對低氧和血管生成的反應。

2.5.3 構建腫瘤類器官 腫瘤類器官能夠復制原發(fā)腫瘤的一些關鍵特性，這種“類器官”培養(yǎng)物適用于大規(guī)模的藥物篩查來檢測與藥物敏感性相關的一些遺傳改變，為采用個體化治療改善癌癥患者的臨床結局鋪平了道路。目前，人們主要還是利用培養(yǎng)皿中的二維細胞系或是在小鼠模型中開展抗癌藥物篩查。腫瘤類器官相對于細胞系更加近似人類腫瘤，且比小鼠模型更節(jié)省時間和資源，為研究人員提供了現(xiàn)有方法之間的一個折中策略。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，Keio大學的研究團隊建立了源自正常腸道上皮的大腸癌類器官[50]。這項發(fā)表在Nature Medicine雜志上的研究，實驗人員通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)向人類正常腸道上皮組織內引入了腫瘤抑制基因APC、SMAD4和TP53突變，以及癌基因KRAS和PIK3CA突變。他們發(fā)現(xiàn)，表達全部五種突變的類器官，不依賴干細胞巢的因子就能在體外生長，而且移植到小鼠腎包膜下會形成腫瘤。進一步研究表明，這種類器官注射到小鼠脾臟之后會發(fā)生微轉移，但癌細胞并不能在肝臟站穩(wěn)腳跟。而源自人類腺瘤的類器官（染色體不穩(wěn)定）在移植后會形成大的轉移集落。這項研究指出，激活通路突變可以在腫瘤微環(huán)境中維持腫瘤干細胞特性，但結直腸癌細胞的侵襲性行為還需要細胞內出現(xiàn)更多的分子損傷。

3 小結

從來沒有哪項生物學技術能像CRISPR/Cas9系統(tǒng)這樣風靡整個科學界，贏得了全世界科學家的熱切關注，并且迅速成為基因編輯的主要技術手段。同樣，隨著該項技術的廣泛應用，CRISPR/Cas9基因編輯技術存在的問題也暴露出來，其中表現(xiàn)最為突出的就是這種基因編輯的脫靶效應[51]。

脫靶效應是指基因編輯系統(tǒng)對目標靶點以外的基因片段進行修飾。由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的向導RNA片段與目標DNA片段只需要20個核苷酸進行匹配，所以這段RNA也極有可能會與目標外的其他片段發(fā)生結合。美國麻省總醫(yī)院的Joung博士的團隊研究[52]發(fā)現(xiàn)這種脫靶位點的突變的確存在，其突變率甚至較目標靶點的突變效率相同甚至更高。因為這種脫靶效應干擾了細胞內其他基因的穩(wěn)定性，由此帶來的非預期的細胞生物學行為和問題也隨之而來，包括基因敲除效率降低、嚴重的細胞毒性出現(xiàn)，以及給腫瘤基因治療帶來的挑戰(zhàn)。面對這些問題，研究者們探索了一系列的方法來改善這種情況，如設計特異程度較高的sgRNA；除靶標外，盡量避免在基因組中sgRNA后緊隨PAM結構；突變Cas9核酸酶的RuvC-like結構域或HNH結構域，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)改造為切口酶，激活細胞的同源重組修復機制，對降低細胞毒性具有一定作用。

目前，隨著基因組信息不斷積累，人類對于基因功能的研究遠遠滯后于發(fā)現(xiàn)新的基因的速度。在這個背景下，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)作為新興的基因編輯技術一經(jīng)發(fā)表，即獲得廣泛的關注。這一高效而簡單的基因編輯技術，為更多的實驗平臺提供了有力的研究基因功能的武器。腫瘤研究作為多年來生物學的研究熱點，也從中獲益匪淺。從單一腫瘤相關基因功能的研究到小鼠腫瘤模型的構建，再到Cas9衍生技術用于腫瘤相關表型基因的篩選以及在腫瘤基因治療中的探索。在短短的2年時間內，CRISPR/Cas9基因編輯技術勢如破竹地解決著腫瘤研究中的一個又一個難題。作為21世紀最為杰出的生物學發(fā)現(xiàn)之一，這項技術勢必會在生物學基因研究領域內掀起一場新的革命，也注定會推進腫瘤研究的快速發(fā)展，并且為更多的腫瘤患者帶去新的希望。